線粒體4977-bp缺失對鼻咽癌的影響

袁妮娜 樓響瑜 冷建杭

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是指發(fā)生于鼻咽腔頂部和側壁的惡性腫瘤，是我國高發(fā)惡性腫瘤之一，發(fā)病率為耳鼻咽喉惡性腫瘤之首。在中國，NPC的高發(fā)區(qū)主要集中在廣東、廣西、湖南、福建和江西5省，其中以廣東省為高發(fā)，發(fā)病率在25/100 000～30/100 000[1]。迄今為止，NPC的發(fā)病機制仍未完全闡明，有研究表明NPC可能由環(huán)境因素、遺傳因素以及EB病毒感染引起，遵循多基因-環(huán)境交互作用的模式[2-4]。然而，大部分遺傳因素方面的研究均集中于核基因，NPC和線粒體基因組的關系目前尚不清楚。線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是一種細胞核外唯一的遺傳物質，全長為16，569-bp[5]。由于mtDNA缺乏組蛋白保護，因此對輻射等氧化損傷較為敏感。此外，mtDNA損傷修復能力低，可造成核酸片段缺失，其中線粒體4977-bp缺失最為常見[6-7]。線粒體4977-bp缺失位于線粒體序列13-bp的正向重復序列（5'-ACCTCCCTCACC-3'），即 8470～8482 和 13447～13459 之間[8]。本研究旨在分析線粒體4977-bp缺失對NPC的影響，并對攜帶該缺失的患者進行線粒體功能分析，探討NPC發(fā)病的可能分子機制。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2019年1至12月在杭州市第一人民醫(yī)院耳鼻喉科手術的NPC患者66例，采集鼻咽纖維鏡活檢的腫瘤組織約50 mg，均經病理確診。其中男44例，女22例；年齡22～61歲，中位年齡40歲。本研究經本院醫(yī)學倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 全基因組DNA提取 采用改進的酚、氯仿、異戊醇提取法提取腫瘤組織中的DNA。首先將腫瘤組織放在1.5 ml離心管中，分別用75%和50%的乙醇和純水梯度脫乙醇，將組織放入研缽中，加入DNA裂解液；隨后將研磨好的組織液加入離心管，并加入10 μl的蛋白酶K，加入等體積的酚后離心，分為3層，吸取上層液，加入飽和酚、氯仿和異戊醇（比例為25:24:1）混合液后搖勻繼續(xù)離心，吸取上清液后加入等體積的氯仿和異戊醇混合液400 μl，離心后加入2.5倍體積的100%乙醇，冷凍過夜后將樣品取出12 000 r/min離心，白色沉淀物即為DNA。將所得的DNA溶于雙蒸水，-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫⒂米贤夥止饷芏葍x檢測所提取的DNA濃度。

1.3 線粒體4977-bp缺失檢測 采用巢式PCR檢測腫瘤組織中線粒體4977-bp缺失情況，利用Primer Premier 5.0軟件設計兩對引物，引物序列見表1。其中外F和外R用于擴增4977-bp缺失區(qū)域兩端較長區(qū)域序列，內F與內R用于擴增4977-bp缺失區(qū)域兩端較短區(qū)域序列。在PCR管中，加入Takara Taq酶0.1 μl，10×Buffer 2 μl，dNTP 2 μl，Mg2+1.5 μl，正反向引物各0.4 μl，模板 DNA 1.2 μl，加入去離子水至 25 μl。反應條件為95℃預變性5 min，95℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸40 s，共35個循環(huán)，72℃延伸5 min。第1次使用外引物進行擴增，第2次使用內引物，模板為第1次PCR的產物。反應結束后取5 μl的PCR產物于加有溴化乙錠的1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

表1 線粒體4977-bp缺失檢測的PCR引物序列

1.4 攜帶線粒體4977-bp缺失患者線粒體功能分析

1.4.1 mtDNA拷貝數(shù)分析 分別抽取2例攜帶線粒體4977-bp缺失患者（NPC-1和NPC-2）和2例性別、年齡相仿的健康體檢者外周靜脈血3 ml，提取基因組DNA。使用線粒體ND1基因來確定mtDNA的拷貝數(shù)，選用β-actin作為看家基因。其中，擴增線粒體ND1基因和β-actin的引物序列見表2。使用熒光定量PCR法檢測mtDNA的拷貝數(shù)，95℃10 min預變性后，95℃變性15 s，60℃退火1 min（熒光檢測）共40個循環(huán)進行擴增，隨后95℃變性15 s，60℃退火1 min，95℃變性15 s，60℃退火15 s進行熔解曲線分析，使用2-ΔΔCt法計算出拷貝數(shù)[9]。

表2 mtDNA拷貝數(shù)檢測所需的引物序列

1.4.2 線粒體ATP水平分析 采用Ficoll密度梯度離心法[10]分離NPC-1和NPC-2患者和2例健康體檢者的外周血單核細胞。ATP定量分析使用CellTiter-Glo發(fā)光法細胞活力檢測試劑盒，方法如下：將CellTiter-Glo試劑直接加入攜帶4977-bp缺失患者和健康體檢者的單核細胞中，10 min后檢測熒光信號強度，細胞裂解產生的發(fā)光信號與ATP含量成正比[11]。

1.4.3 活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平分析由于ROS是線粒體產生的氧自由基，對細胞、組織和蛋白有一定的損傷作用，ROS的過量表達是線粒體功能損傷的指標[12]。ROS的檢測基于一種熒光染料2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2',7'-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）的強度，DCFH-DA 本身沒有熒光，進入細胞后，被細胞內的酯酶水解成2',7'-二氯二氫熒光素（2',7'-Dichlorodi-hydrofluorescein，DCFH），和探針特異性結合，細胞內的ROS可以氧化無熒光的DCFH變成有熒光的2',7'-二氯熒光素（2',7'-Dichlorofluorescein，DCF），熒光強度與ROS水平成正比，使用流式細胞儀計算熒光強度，計算ROS水平[13]。

2 結果

2.1 線粒體4977-bp缺失情況 巢式PCR法可以擴增出358-bp的片段，而不含4977-bp缺失的個體，無法擴增出358-bp的片段，見圖1。66例NPC患者中有2例攜帶線粒體4977-bp缺失（NPC-1和NPC-2），檢出率為3.03%。

圖1 線粒體4977-bp缺失的巢式PCR電泳圖[孔道1為空白對照，孔道2和3表示攜帶線粒體4977-bp缺失的樣本（NPC-1和NPC-2）]

2.2 mtDNA拷貝數(shù)分析 mtDNA拷貝數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，NPC-1和NPC-2的mtDNA拷貝數(shù)分別為161.5和167.0，遠高于健康體檢者的70.6。

2.3 線粒體ATP水平分析 ATP水平檢測發(fā)現(xiàn)，NPC-1和NPC-2的ATP含量分別為57.0和63.0，明顯低于健康體檢者的140.66。

2.4 ROS定量分析 ROS定量分析發(fā)現(xiàn)，NPC-1和NPC-2患者的ROS水平分別為99.0、107.5 U/ml，明顯高于健康體檢者的45.6 U/ml。

3 討論

早在1956年，生物學家Warburg[14]在癌細胞中首次發(fā)現(xiàn)了一種稱為“有氧糖酵解”現(xiàn)象，就是大多數(shù)癌細胞即使在有充分氧供應的條件下仍主要通過糖酵解途徑而不是氧化磷酸化途徑來獲得ATP用于維持自身代謝及分裂增殖，同時產生大量乳酸代謝產物，該效應也稱為Warburg現(xiàn)象，為癌細胞線粒體功能障礙的研究奠定了基礎。

由于線粒體基因組缺乏保護性組蛋白，修復能力非常有限，本身又是產生ROS的主要場所，因此mtDNA的突變率遠高于核DNA[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA的4977-bp缺失是一種較為常見的突變，在癌癥中尤為常見[16-17]。Guo等[18]對105例肝癌患者進行了線粒體4977-bp缺失的篩查，發(fā)現(xiàn)有10個患者攜帶該大片段的缺失。Tan等[19]應用PCR技術分析乳腺癌腫瘤組織中常見的4977-bp缺失，19例腫瘤標本均未檢測到該缺失。沈慧等[20]對52例新鮮胃癌標本的研究表明4977-bp缺失陽性率為73.1%。從分子結構上看，線粒體4977-bp的缺失位于核苷酸位點的8470～13446之間的區(qū)域，缺失區(qū)編碼 5 個線粒體 tRNA、A8、A6、CO3、ND3、ND4L、ND4和ND5。因此，4977-bp的大片段缺失會影響線粒體的結構和功能，引起線粒體功能損傷，但是具體的分子機制尚不清楚。

本研究中，筆者首先利用巢式PCR法對NPC患者進行了線粒體4977-bp缺失的檢測，共發(fā)現(xiàn)2例NPC患者攜帶這個大片段的缺失，檢出率為3.03%；并對2例攜帶線粒體4977-bp缺失的NPC患者和2例健康體檢者進行了線粒體功能研究，包括mtDNA拷貝數(shù)、ATP和ROS水平。本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶4977-bp缺失NPC患者的mtDNA拷貝數(shù)和ROS明顯高于健康體檢者，而ATP水平明顯低于健康體檢者。筆者認為mtDNA對很多致癌因素敏感，是ROS攻擊的主要目標，當細胞受到外源性物質的攻擊時，使得線粒體總呼吸的代償，導致mtDNA的拷貝數(shù)增高。在癌細胞缺氧的情況下，線粒體氧化磷酸化功能受到抑制，ROS水平急劇上升，但是超氧化物歧化酶由于酶的活性改變，清除能力下降，引起線粒體大片段的缺失[21]。此外，由于線粒體功能損傷，呼吸鏈合成受阻，導致ATP水平下降，進而參與了NPC的發(fā)病進程。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)線粒體4977-bp缺失和NPC有關，很有可能是通過影響線粒體氧化磷酸化功能而參與了NPC的發(fā)病進程，本研究為NPC的發(fā)病機制提供了新思路。本研究不足之處是標本量較少，需要繼續(xù)擴大樣本量來開展后續(xù)的工作。