血清膽汁酸亞組分TDCA與腦卒中高危人群發生心腦血管事件的關系

夏鵬 夏駿

腦卒中是一種急性腦血管疾病，是由于腦部血管突然破裂或因血管阻塞導致血液不能流入大腦而引起腦組織損傷的一組疾病。腦血管病目前已躍升為國民死亡原因之首，成為我國最為嚴峻的公共衛生問題之一[1]。膽汁酸在臨床上雖然是評價肝膽功能的常用指標，但膽汁酸在體內的代謝和運轉與血脂特別是膽固醇代謝有密切聯系[2]。已有研究表明，膽汁酸水平高表達是頸動脈出現斑塊的高危因素，與腦卒中等心腦血管事件發生有一定相關性。但部分研究結果顯示，在冠心病患者中總膽汁酸水平是降低的[3]。這些結果不一致的原因可能是因為目前臨床上檢測分析的是總膽汁酸水平，忽略了真正發揮作用的膽汁酸亞組分，因此不同膽汁酸亞組分在腦卒中等心腦血管事件發生中的作用值得進一步深入分析。本研究采用質譜技術分析腦卒中高危人群膽汁酸亞組分水平，探討不同膽汁酸亞組分在心腦血管事件發生中的作用，以及其與臨床和實驗室指標的關系，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 2013年4至5月，從浙江省人民醫院周邊街道15 933名＞40歲居民的信息中篩查出腦卒中高危人群835例，失訪12例，最終符合標準823例，其中男 350 例，女 473 例，年齡 41～88（68.07±8.51）歲。納入標準[4]：血脂異常，高血壓，糖尿病，心房顫動和（或）心瓣膜病等心臟疾病，運動缺乏（鍛煉次數＜3次/周且＜30 min/次），吸煙（吸煙≥1支/d且＞1年者），肥胖或明顯超重（BMI≥26 kg/m2），有腦卒中家族史。符合以上≥3個高危因素，或著既往有缺血性卒中患者和（或）短暫性腦缺血發作（transient ischemic attack,TIA）病史者即為腦卒中高危人群。排除標準：嚴重肝腎疾病、腫瘤、精神疾病和全身性免疫疾病者，在隨訪期內失訪或資料不完整者。該項篩查已得到醫院倫理審查委員會批準（批準文號：2020QT357）。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）聯用檢測血清中膽汁酸亞組分水平 所有受檢者均隔夜空腹8 h以上，清晨抽靜脈血3.5 ml，分離血清，-20℃保存，檢測膽汁酸亞組分脫氧膽酸（deoxycholicacid,DCA）、甘氨脫氧膽酸（glycodeoxycholic acid,GDCA）和?；敲撗跄懰幔╰aurodeoxycholic acid,TDCA）水平。

通過內標加入-標準曲線法對膽汁酸進行定量分析檢測。標準物質購于美國Sigma公司，標準溶液基質采用經活性炭吸附內源性膽汁酸的血清。6個濃度梯度的標準品通過內標校正后建立標準曲線。LC-MS/MS分析儀使用美國SCIEX液相色譜串聯四極桿質譜Triple Quad 4500MD，采用日本島津UPLC系統進行膽汁酸組分分離，色譜柱為Accucore C18柱（100×2.0 mm，2.6 μm），流動相分別為5 mmol/L乙酸銨水溶液和純甲醇，流速0.85 ml/min，上樣量50 μl，采用梯度洗脫后進入質譜，通過多反應監測（multiple reaction monitoring,MRM）模式進行定量檢測。每批檢測用雙水平質控血清進行嚴格的室內質控。

1.2.2 臨床指標的收集 收集所有入選者身高、體重、腰圍，測量收縮壓和舒張壓。采用頸部血管超聲技術檢查患者雙側頸總動脈、頸動脈竇、頸內動脈、鎖骨下動脈及椎動脈，觀察頸動脈狹窄情況。

1.2.3 實驗室指標檢測 所有入選者空腹12h后于清晨靜脈采血3 ml，靜置15 min待血漿析出后，3 500 r/min離心10 min分離血清。使用全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特，AU5800）檢測 FPG、TC、TG、HDL-C、LDLC、游離脂肪酸（free fatty acid,FFA）、尿酸（uric acid,UA）、γ谷氨酰轉肽酶（gamma-glutamyltransferase,GGT）、同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）、血清胱抑素 C（cystatin C,CysC）、超敏C反應蛋白（high-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP）、脂蛋白 a（lipoprotein a,LPa）、小而密低密度脂蛋白（small dense low-density lipoprotein,sdLDL）、脂蛋白相關磷脂酶 A2（lipoprotein-associated phospholipase A2,Lp-PLA2）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）和 α-羥丁酸脫氫酶（α-Hydroxybutyrate Dehydrogenase,αHBDH）。并計算非高密度脂蛋白（nonHDL）含量（計算公式=TC－HDL-C）。按Westgard質控規則，每天用雙水平質控血清進行嚴格的室內質控。使用化學發光分析儀（瑞士羅氏診斷，Cobas8000）檢測血清胰島素水平。

1.2.4 隨訪 對所有入選者進行電話或門診隨訪。隨訪5年，隨訪內容：是否發生心腦血管（心臟病和腦卒中）不良事件。心腦血管不良事件定義為因心臟病或腦卒中死亡、非致死性心肌梗死、冠心病、腦卒中入院[5]。根據隨訪結果分為觀察組（發生心腦血管不良事件者）和對照組（未發生心腦血管不良事件者）。根據腦卒中高危人群TDCA水平四分位數（P25=0.01 μmol/L；P50=0.027 μmol/L；P75=0.053 μmol/L）分成 Q1 組（0～＜0.010 μmol/L）、Q2 組（0.010～＜0.027 μmol/L）、Q3 組（0.027～＜0.053 μmol/L）和 Q4 組（≥0.053 μmol/L）。

2 結果

2.1 腦卒中高危人群隨訪結果 隨訪5年，發生心腦血管事件者27例（觀察組），其中男10例，女17例，年齡 54～86（74.00±6.82）歲；發生冠心病、心肌梗死等心血管疾病10例，發生腦卒中、腦梗死、TIA 17例。選擇年齡、性別接近的未發生心腦血管事件者37例（對照組），其中男 13 例，女 24 例，年齡 54～85（68.00±7.92）歲。

2.2 兩組膽汁酸亞組分水平比較 見表1。

表1 兩組膽汁酸亞組分水平比較（μmol/L）

由表1可見，觀察組TDCA水平高于對照組（P＜0.05），GDCA、TDCA和總DCA比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

2.3 不同TDCA水平腦卒中高危人群發生不良心腦血管事件的風險 見表2。

由表2可見，經過單因素及多因素logistics回歸分析，Q4組發生心腦血管事件的風險高于Q1組（P＜0.05）：模型1顯示Q4組發生心腦血管事件的風險是Q1組的8.250倍；模型2顯示Q4組發生心腦血管事件的風險是Q1組的7.671倍；模型3顯示Q4組發生心腦血管事件的風險是Q1組的98.594倍。

表2 不同TDCA水平腦卒中高危人群發生不良心腦血管事件的風險

2.4 TDCA水平與臨床和實驗室指標的相關性分析 見表3。

由表3可見，TDCA水平與Hcy、胰島素和GGT均有關（均 P＜0.05）。

表3 TDCA水平與臨床和實驗室指標的相關性分析

3 討論

膽汁酸是肝細胞以膽固醇為原料合成并分泌膽汁的一大類膽烷酸的總稱，在對脂類物質的消化吸收中發揮了重要的生理意義。隨著檢測技術的進步，目前能夠利用質譜技術對不同疾病或生理狀態下多種膽汁酸亞組分進行精確的分析，包括在不同肝膽疾病中的表達情況[6]、在妊娠期膽汁淤積癥患者中的表達情況等[7]。

本研究利用質譜技術分析了腦卒中高危人群中膽汁酸亞組分DCA、GDCA和TDCA水平，并比較了發生和未發生心腦血管事件組上述指標的表達情況。研究結果發現TDCA在發生心腦血管事件患者中表達增高；將TDCA根據四分位水平分組，通過建立單因素及多因素logistic回歸模型，顯示Q4組發生心腦血管事件的風險高于Q1組。結果提示高水平TDCA的腦卒中高危人群更有可能發生心腦血管事件，TDCA的表達與疾病發展有關。

除傳統的生理作用外，膽汁酸現在被認為是與細胞膜和核受體同時相互作用的信號分子，有研究表明，通過與這些受體的相互作用，TDCA等可調節自身合成、糖和能量代謝[8]。TDCA的這種表現可能與膽汁酸的親疏水性有關。膽汁酸分子中既有親水基團又有疏水基團，因此同時具有親水性和疏水性。疏水性膽汁酸又稱為毒性膽汁酸，疏水性越強的膽汁酸對人體的破壞性越大。疏水性膽汁酸按疏水性排列依次為石膽酸（lithocholiacid,LCA）＞DCA＞鵝脫氧膽酸（chenodeoxycholicacid,CDCA）＞膽酸（cholicacid,CA）＞熊脫氧膽酸（ursodeoxycholic acid,UDCA）[9]。TDCA 是一種疏水性膽汁酸，可以誘導線粒體產生活性氧并轉換膜通透性，從而導致線粒體功能紊亂[10]。同時，疏水性膽汁酸還能激活死亡受體以及刺激產生促炎介質[11]。但TDCA等疏水性膽汁酸誘導心腦血管事件發生的具體機制還需進一步研究。

本研究分析了TDCA水平與臨床和實驗室指標的相關性，結果顯示TDCA與Hcy、GGT和胰島素有一定的相關性。已有研究表明，Hcy高表達是心腦血管疾病的獨立危險因素，并且Hcy高表達和高血壓在心腦血管疾病中起協同作用[12-13]。GGT能水解谷胱苷肽生成甘氨酸和半胱氨酸，甘氨酸能還原Fe3+并產生大量超氧陰離子，氧化LDL-C生成氧化的LDL-C，最終導致動脈硬化[14]。有研究表明，GGT是急性缺血性腦卒中患者與頸動脈硬化的獨立危險因素。TDCA與這些指標的相互作用，共同導致心腦血管事件的發生。

本研究通過對腦卒中高危人群5年的跟蹤隨訪，發現高水平TDCA患者較低水平患者發生心腦血管事件的風險更高，因此TDCA指標需要引起臨床醫師的關注和重視。本研究在建立logistic回歸模型時，樣本量對數值的穩定性有一定影響，因此需要后期加大樣本量或開展多中心研究進一步分析證實。