產氣莢膜梭菌ε毒素重組突變體大腸桿菌表達條件的優化

朱 真，杜吉革，薛 麒，李啟紅，印春生，張瑩輝，李倩琳，姚文生，陳小云

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)舊稱魏氏梭菌(C.welchii)或產氣莢膜桿菌(Bacillus perfringens)[1]，1891年，由醫學博士Wlliam H. Welch和同事進行尸檢時發現。它是一種重要的人畜共患細菌性病原，廣泛存在于土壤、污水、食物等自然環境以及動物及人類的腸道中[2]。作為條件致病菌，能引起多種動物，包括綿羊、山羊、牛、豬、禽類、犬、家兔、馴鹿、羊駝等壞死性腸炎、腸毒血癥，并能導致人的氣性壞疽和食物中毒。菌體自身不致病，依靠其分泌的外毒素造成機體損害[3]，主要分泌α、β、ε、ι四種外毒素，而根據毒素產生種類的不同，該菌可分為A、B、C、D、E五型[2]。由B型和D型產氣莢膜梭菌產生的ε毒素[4]，對小鼠的LD50為100 ng/kg，在該菌所有外毒素中毒力最強，也是繼肉毒桿菌毒素和破傷風毒素之后的世界第三大毒力細菌外毒素，是潛在的生物恐怖主義戰劑，被美國疾控中心(CDC)列為B類生物制劑[5]。

疫苗免疫是防制產氣莢膜梭菌病的重要手段，而目前廣泛應用的類毒素疫苗存在諸多弊端，如生產過程需添加動物組織、批間差異大、抗原成分復雜、有效抗原含量低。為此，本研究在前期產氣莢膜梭菌突變體研究[12]的基礎上，對突變體重組蛋白表達條件進行優化，使可溶性表達比例進一步提高，這將為產氣莢膜梭菌突變體的進一步研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 pETXm3質粒為本實驗室保存； 12%SDS PAGE預制蛋白膠、NuPAGETMMES SDS Running Buffer (20X)、NuPAGETMTransfer Buffer (20X)；BL21(DE3)感受態細胞、IPTG購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；硫酸卡那霉素購自北京索萊寶科技有限公司；PBS、LB培養基購自北京中海生物科技有限公司；蛋白Marker購自康潤生物。

1.2 方法

1.2.1 誘導溫度的優化 將pETXm3質粒轉化至BL21(DE3)感受態細胞，將成功轉化至E.coliBL21(DE3)感受態細胞的菌液分別接種于LB肉湯培養基(Kana 30 μg/mL)，37 ℃培養過夜，再以1%比例分別接種于LB肉湯培養基(Kana 30 μg/mL)5000 mL，37 ℃振蕩培養至菌液OD600為0.4～0.6時，加入IPTG(0.5 m mol/L)進行誘導表達，分別取1000 mL菌液，在17 ℃、22 ℃、27 ℃、32 ℃和37 ℃下各振蕩培養4 h。各取10 mL菌液，4 ℃ 12000 rpm離心1 min，棄上清，分別以10 mL PBS重懸沉淀，后使用高壓破碎儀進行菌體細胞裂解。分別取裂解液1 mL，4 ℃ 12000 rpm離心5 min，收集上清，沉淀分別用1 mL PBS復溶。以未誘導菌液裂解液作為陰性對照，取不同溫度下誘導的裂解菌液的上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，比較不同誘導溫度對蛋白表達的影響。

1.2.2 表達菌不同生長期對重組蛋白表達的影響 將成功轉化至E.coliBL21(DE3)感受態細胞的菌液分別接種于LB肉湯培養基(Kana 30 μg/mL)，37 ℃培養過夜，再以1%比例接種于含5000 mL LB肉湯培養基(Kana 30 μg/mL)，37 ℃振蕩培養，每隔1 h取菌液進行OD600測定，以時間為橫坐標，以OD600為縱坐標繪制表達菌生長曲線。同時，分別在培養2、4、6、8 h和10 h各取菌液1000 mL，加入IPTG(0.5 m mol/L)進行誘導表達，37 ℃振蕩4 h收獲。分別取不同時間點的誘導菌液，4 ℃ 12000 rpm離心1 min，棄上清，分別以10 mL PBS重懸沉淀，后使用高壓破碎儀進行菌體細胞裂解。分別取裂解液1 mL，4 ℃ 12000 rpm離心5 min，收集上清，沉淀分別用1 mL PBS復溶。以未誘導菌液裂解液作為陰性對照，取不同溫度下誘導的裂解菌液的上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，比較不同生長期對重組蛋白表達的影響。

1.2.3 誘導時間的優化 將成功轉化至E.coliBL21(DE3)感受態細胞的菌液分別接種于LB肉湯培養基(Kana 30 μg/mL)，37 ℃培養過夜，再以1%比例接種于LB肉湯培養基(Kana 30 μg/mL)5000 mL，37 ℃振蕩培養至菌液OD600為0.895～1.295時，加入IPTG(0.5 m mol/L)進行誘導表達，分別取1000 mL，在37 ℃下振蕩培養2、4、6、8 h。各取10 mL菌液，4 ℃ 12000 rpm離心1 min，棄上清，分別以10 mL PBS重懸沉淀，后使用高壓破碎儀進行菌體細胞裂解。各取裂解液1 mL，4 ℃ 12000 rpm離心5 min，收集上清，沉淀分別用1 mL PBS復溶。以未誘導菌液裂解液作為陰性對照，取不同溫度下誘導的裂解菌液的上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，比較不同誘導時間對蛋白表達的影響。

1.2.4 IPTG濃度的優化 將成功轉化至E.coliBL21(DE3)感受態細胞的菌液分別接種于LB肉湯培養基(Kana 30 μg/mL)，37 ℃培養過夜，再以1%比例接種于LB肉湯培養基(Kana 30 μg/mL)2瓶，5000 mL/瓶，37 ℃振蕩培養至菌液OD600為0.895～1.295時，將2瓶菌液混勻，分別取1000 mL，分別加入濃度為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mM 的IPTG進行誘導，在37 ℃下分別振蕩培養4 h后，各取10 mL菌液，4 ℃ 12000 rpm離心1 min，棄上清，分別以10 mL PBS重懸沉淀，后使用高壓破碎儀進行菌體細胞裂解。各取裂解液1 mL，4 ℃ 12000 rpm離心5 min，收集上清，沉淀分別用1 mL PBS復溶。以未誘導菌液裂解液作為陰性對照，取不同溫度下誘導的裂解菌液的上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，比較不同IPTG濃度對蛋白表達的影響。

2 結 果

2.1 重組蛋白表達條件優化

2.1.1 誘導溫度的優化E.coliBL21(pETXm3)經IPTG在17 ℃、22 ℃、27 ℃、32 ℃和37 ℃條件下誘導表達，從SDS-PAGE電泳圖中可得知，目的蛋白主要以可溶表達為主，且37 ℃條件下目的蛋白可溶性表達量最高，故選擇37 ℃作為最佳誘導溫度。

a.誘導溫度對重組蛋白(上清)表達的影響；b. 誘導溫度對重組蛋白(沉淀)表達的影響a. Effect of induction temperature on recombinant protein(supernatant)expression；b. Effect of induction temperature on recombinant protein(precipitation)expression；M.蛋白marker；NC1.未誘導菌細胞裂解上清；NC2.未誘導細胞裂解沉淀；1/2/3/4. 17/22/27/32/37 ℃誘導細胞裂解上清；6/7/8/9. 17/22/27/32/37 ℃誘導細胞裂解沉淀。Lane M. protein marker；Lane NC1. The supernatant of cell lysates without induction；Lane NC2. The precipitation of cell lysateswithout induction；Lane 1/2/3/4. The supernatant of cell lysates induced under 17/22/27/32/37 ℃；Lane 6/7/8/9. The precipitation of cell lysates induced under 17/22/27/32/37 ℃.圖1 誘導溫度對重組蛋白表達的影響Figure 1 Effect of induction temperature on recombinant protein expression

2.1.2 表達菌不同生長期對重組蛋白表達的影響以時間為橫坐標，以菌液OD600為縱坐標，繪制E.coliBL21(pETXm3)生長曲線，如表1和圖2所示，細菌生長0～1 h為遲緩期，細菌緩慢生長；2～13 h為對數期，細菌快速生長，菌液OD600從0.090升至1.423，且1～4 h生長速率最大，5～13 h生長趨于平穩；14～16 h細菌生長進入穩定期，OD600維持在1.402～1.404，生長速率接近為零。

圖2 E.coli BL21(pETXm3)生長曲線Fig 2 The growth curve of E.coli BL21(pETXm3)

表1 不同培養時間E.coli BL21(pETXm3)菌液OD600Table 1 Bacterial broth OD600 of E.coli BL21(pETXm3)at different culture times

不同生長期重組蛋白表達情況如圖3所示，E.coliBL21(pETXm3)培養2 h(OD600值0.259)時，目的蛋白表達量較少，從4 h(OD600值0.715)起表達量開始積累，且存在可溶表達，6～10 h(OD600值0.895～1.295)表達量差異較小，為目的蛋白表達量高峰期，直至培養12 h(OD600值1.339)時表達量開始下降。從以上分析可知，表達菌OD600為0.895～1.295時開始誘導，目的蛋白表達量較高。

M.蛋白marker；NC1.未誘導菌細胞裂解物上清；NC2.未誘導菌細胞裂解物沉淀；1/2/3/4/5/6. 培養2 h/4h/6 h/8 h/10 h/12 h后誘導菌液細胞裂解上清；7/8/9/10/11/12. 培養2 h/4 h/6 h/8 h/10 h/12 h后誘導菌液細胞裂解沉淀。Lane M. protein marker；Lane NC1. The supernatant of cell lysates without induction；Lane NC2. The precipitation of cell lysates without induction；Lane 1/2/3/4/5/6. The induced supernatant of cell lysates induced after 2 h/4 h/6 h/8 h/10 h/12 h incubation；Lane 7/8/9/10/11/12. The induced precipitation of cell lysates induced after 2 h/4 h/6 h/8 h/10 h/12 h incubation.圖3 不同生長期E.coli BL21(pETXm3)重組蛋白的表達Fig 3 Expression of recombinant protein of E.coli BL21 (pETXm3) in different growth periods

2.1.3 誘導時間的優化E.coliBL21(pETXm3)經IPTG在37 ℃條件下分別進行2、4、6和8 h誘導表達，從SDS-PAGE電泳圖中可得知，目的蛋白在最佳溫度37 ℃誘導4 h后表達量開始增多并趨穩，誘導4、6和8 h的表達量彼此差異不大，但從圖中可看出，誘導6 h無論是可溶蛋白還是包涵體的表達量，相對較多，故選擇誘導6 h為最佳誘導時間。

M.蛋白marker；NC1.未誘導菌細胞裂解物；1/2/3/4. 誘導2 h/4 h/6 h/8 h后細胞裂解上清；5/6/7/8. 誘導2 h/4 h/6 h/8 h后細胞裂解沉淀。Lane M. protein marker；Lane NC1. The supernatant of cell lysates without induction；Lane 1/2/3/4. The supernatant of cell lysates induced with IPTG for2 h/4 h/6 h/8 h；Lane 5/6/7/8. The precipitation of cell lysates induced with IPTG for2 h/4 h/6 h/8 h.圖4 誘導時間對重組蛋白表達的影響Fig 4 Effect of induction time on recombinant protein expression

2.1.4 IPTG濃度的優化E.coliBL21(pETXm3)分別經0.4、0.8、1.2、1.6、2.0和2.4 mM IPTG誘導，在37 ℃條件下振蕩培養4 h后，蛋白表達情況如圖5所示，0.4～2.4 mM IPTG 誘導下，目的蛋白在上清中均有一定量表達，1.6 mM時可溶性蛋白表達量最高，比例可達40%，故選擇1.6 mM 作為最佳IPTG誘導濃度。

M.蛋白marker；NC.未誘導菌細胞裂解物；1/2/3/4/5/6. IPTG濃度0.4 mM/0.8 mM/1.2 mM/1.6 mM/2.0 mM/2.4 mM 誘導后細胞裂解上清；7/8/9/10/11/12. IPTG濃度0.4 mM/0.8 mM/1.2 mM/1.6 mM/2.0 mM/2.4 mM 誘導后細胞裂解沉淀。Lane M. protein marker；Lane NC. The cell lysates without induction；Lane1/2/3/4/5/6.The supernatant of cell lysates induced with0.4 mM/0.8 mM/1.2 mM/1.6 mM/2.0 mM/2.4 mM IPTG；Lane7/8/9/10/11/12. The precipitation of cell lysates induced with0.4 mM/0.8 mM/1.2 mM/1.6 mM/2.0 mM/2.4 mM IPTG.圖5 IPTG濃度對蛋白表達的影響Fig 5 Effect of IPTG concentration on protein expression

3 討論與結論

隨著現代生物技術發展，許多外源蛋白通過基因技術工程在不同表達系統中得到了高效、正確的表達，并在生物制品、食品、醫藥等領域廣泛應用。外源基因表達系統又有原核和真核之分，其中原核表達應用較多的表達系統有大腸桿菌和枯草芽孢桿菌；真核表達系統則主要為酵母、昆蟲桿狀病毒以及哺乳動物細胞[6]。大腸桿菌表達系統具有遺傳背景清楚、易于操作、培養周期短、成本低廉、使用安全等諸多優點，故本研究使用全球廣泛使用的大腸桿菌PET系列表達載體，T7啟動子支配下，一經加入IPTG誘導劑，外源蛋白即可開始高效表達。影響蛋白表達的因素有很多，同類研究大多選擇誘導劑IPTG濃度、誘導溫度、誘導時間這些項目進行優化[7-9]，除此之外，還有培養基pH值[10]、溶氧量、補料碳源等[11]，但后3種因素更適用于實際生產中大規模發酵，本研究不再進行詳細比較。故本研究選取了常見的誘導劑IPTG濃度、誘導溫度、誘導時間這三項優化條件，除此之外，還對誘導菌液濃度對可溶蛋白表達量的影響進行了分析，因為細菌不同生長時期，菌密度、酶活性、代謝速度均有不同，這將對外源蛋白表達具有直接影響。

前期研究中構建的ε毒素的重組突變體為可溶性表達[12]，所以本研究重點關注如何提高上清中目的蛋白表達量。在比較誘導菌液濃度對可溶蛋白表達量的影響時，經過測得菌液OD600值為0.090～ 1.423時處于生長對數期，1.423以后進入穩定期，而本研究獲得最佳誘導狀態OD600值0.895～1.295正是處于生長對數期的中后階段，培養基營養相對較多，酶活性較強，菌密度適中，所以最適于外源蛋白表達。此外將37 ℃作為最佳誘導溫度，在實踐生產中具有十分重要的意義，因為誘導溫度越高，導致蛋白合成速度越快，有些時候過多的蛋白來不及正確折疊而導致包涵體產生，而包涵體在后期復性時需要費時費力且不一定和原蛋白天然構象一致，為了達到可溶表達效果，誘導溫度甚至是低溫。本研究將37 ℃作為最佳誘導溫度，省去了實際生產中低溫冷卻的工序，能極大降低生產成本，具有較好應用前景。綜上所述，37 ℃、菌液OD600值為0.895～1.295時，以1.6 mM IPTG誘導6 h條件下可溶性表達量最高，這將為產氣莢膜梭菌突變體的進一步研究提供依據。