高效液相色譜法測(cè)定蒿板青顆粒中一枝蒿酮酸及(R, S)-告依春的含量

皇甫通，馮清強(qiáng)，周家平，馬成俊，毛瑞華，楊 磊，李 巖，王振華*

(1.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺(tái)264005；2.煙臺(tái)海研制藥有限公司，煙臺(tái)264005)

新獸藥蒿板青顆粒的原處方為人用藥復(fù)方一枝蒿顆粒，其收載于《國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》內(nèi)科肺系(一)分冊(cè)(WS-10018(ZD-0018)-2002)，具有解表祛風(fēng)，涼血解毒，用于邪毒所致的感冒發(fā)燒，咽喉腫痛，病毒性感冒的治療。該處方在常用中藥復(fù)方板藍(lán)根顆粒(成分：板藍(lán)根、大青葉)的基礎(chǔ)上，加入具有清熱解毒的維藥新疆一枝蒿組方，板藍(lán)根、大青葉與新疆一枝蒿的生藥比例為1∶1∶1，經(jīng)過(guò)水提醇沉、濃縮、加工制粒而成[1]，體外活性研究及多年臨床應(yīng)用表明，和復(fù)方板藍(lán)根顆粒相比該藥物在抗炎、抗菌、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等方面顯示出更為優(yōu)良的療效[2-6]。獸藥板青顆粒收載于《中國(guó)獸藥典》2015版二部，由板藍(lán)根和大青葉兩味中藥材經(jīng)水煎煮、濾過(guò)和濃縮、加工制粒而成，具有清熱解毒、涼血功效，廣泛用于畜禽風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、熱病發(fā)斑等溫?zé)嵝约膊》乐巍ｈb于此，我們?cè)诙嗄晟a(chǎn)使用獸藥板青顆粒的基礎(chǔ)上，對(duì)人用藥復(fù)方一枝蒿顆粒的生產(chǎn)工藝和針對(duì)畜禽風(fēng)熱感冒初步藥效學(xué)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，比較其相對(duì)于板青顆粒的優(yōu)勢(shì)，決定將其開(kāi)發(fā)為用于防治獸禽溫?zé)嵝约膊〉乃幬铮麨椤拜锇迩囝w粒”，現(xiàn)已完成臨床前及臨床研究。人用藥“復(fù)方一枝蒿顆粒”、“復(fù)方板藍(lán)根顆粒”和“獸藥板青顆粒”質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均無(wú)有效物質(zhì)定量控制方法，實(shí)驗(yàn)針對(duì)蒿板青顆粒制備工藝特點(diǎn)及獸藥質(zhì)量控制要求，以新疆一枝蒿的有效物質(zhì)一枝蒿酮酸和板藍(lán)根中的有效物質(zhì)(R, S)-告依春為指標(biāo)成分，研究建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定蒿板青顆粒中一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春的方法，并根據(jù)《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》的要求[7]，對(duì)上述方法進(jìn)行了驗(yàn)證，為蒿板青顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料 一枝蒿酮酸對(duì)照品，批號(hào)：20190522，中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所；(R,S)-告依春對(duì)照品，批號(hào)：111753-201706，中國(guó)食品藥品檢定研究院；三批蒿板青顆粒中試樣品(批號(hào)：190201、190202、190203)，煙臺(tái)海研制藥有限公司提供；不含新疆一枝蒿及板藍(lán)根的陰性對(duì)照樣品(自制)；乙腈為色譜純，磷酸為分析純，均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，水為超純水(自制)。

1.2 儀器 Sartorius十萬(wàn)分之一電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；Agilent 1260四元高效液相色譜儀配1260 UV檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司)；DSA300-SK1-12L型超聲波清洗機(jī)(福州仟度電子儀器有限公司)。全波長(zhǎng)紫外掃描儀uv-9000(上海元析儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 以甲醇做為溶劑，將一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春對(duì)照品分別制成10 μg/mL的溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍下掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。一枝蒿酮酸的λmax=245 nm；(R, S)-告依春的λmax=243 nm，參考文獻(xiàn)資料[9-13]，確定245 nm做為高效液相色譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春的紫外光譜圖Fig 1 UV spectra of Rupestonic acid and (R, S)-epigoitrin

表1 含量測(cè)定梯度洗脫條件Tab 1 Gradient elution condition for content determination

2.3 溶液制備

2.3.1 對(duì)照品溶液制備 取一枝蒿酮酸對(duì)照品約30 mg，(R, S)-告依春對(duì)照品約6 mg，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含有120 μg /mL(R, S)-告依春與600 μg /mL一枝蒿酮酸對(duì)照品混合儲(chǔ)備液；精密量取對(duì)照品混合儲(chǔ)備液1.5 mL，置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為7.2 μg /mL(R, S)-告依春與36 μg /mL一枝蒿酮酸的對(duì)照品混合溶液。

2.3.2 供試品溶液制備 取蒿板青顆粒(批號(hào)：190201)，研磨成粉，取約6 g細(xì)粉，精密稱定，置于100 mL具塞容量瓶中，精密量取50 mL 80%甲醇，密塞，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，取濾過(guò)液，即得。

2.3.3 陰性對(duì)照溶液制備 按照處方量及制備工藝，分別制備輔料、不含新疆一枝蒿、不含板藍(lán)根的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備空白溶液和陰性樣品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性和專屬性試驗(yàn) 分別量取空白溶液、一枝蒿酮酸與(R, S)-告依春對(duì)照品混合溶液、蒿板青顆粒溶液和陰性對(duì)照溶液，按 2.2項(xiàng)色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。在該色譜條件下，一枝蒿酮酸的保留時(shí)間在36 min 左右，(R, S)-告依春的保留時(shí)間在9 min左右，分離度達(dá)到1.5以上，理論塔板數(shù)大于3000，陰性樣品在此時(shí)間附近無(wú)吸收峰。結(jié)果表明，系統(tǒng)適用性可以滿足檢測(cè)要求；處方中其它成分對(duì)一枝蒿酮酸與(R, S)-告依春定量檢測(cè)無(wú)干擾，說(shuō)明該方法能滿足檢測(cè)要求。

(A)空白溶液(輔料)；(B)混合對(duì)照；(C)陰性樣品(缺板藍(lán)根);(D)陰性樣品(缺新疆一枝蒿);(E)蒿板青顆粒；a. (R, S)-告依春；b. 一枝蒿酮酸(A)Blank solution;(B)Control；(C)Negative sample (Lack Radix Isatis tinctoria Fort.)(D)Negative sample (Lack Artemisia rupestris L．);(E)Haobanqing granules； a. (R, S)-epigoitrin; b. Rupestonic acid圖2 樣品中(R,S)- 告依春與一枝蒿酮酸高效液相圖Fig 2 HPLC chromatogram of (R, S)-epigoitrin and Rupestonic acid in sample

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取混合儲(chǔ)備液1、1.5、2、3、4、5 mL，分別置于25 mL的容量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，一枝蒿酮酸的濃度分別為：24、36、48、72、96、120 μg /mL；(R,S)-告依春的濃度分別為4.8、7.2、9.6、14.4、19.2、24 μg /mL。按照2.2項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X)為橫坐標(biāo)，作線性回歸，一枝蒿酮酸的回歸方程為y= 57.667x-120.680，R2=0.9992；(R,S)-告依春的回歸方程為y= 152.340x-274.890，R2=0.9997。一枝蒿酮酸在24～120 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；(R, S)-告依春在4.8～24 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 取線性試驗(yàn)項(xiàng)下的混合貯備液(一枝蒿酮酸的濃度為600 μg /mL，(R, S)-告依春的濃度為120 μg /mL)3 mL，置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。按 2.2 項(xiàng)下的色譜條件重復(fù)測(cè)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果顯示，一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別1.72%、1.50%，表明精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(批號(hào)190201)，制備成適宜濃度，按照2.2項(xiàng)下的色譜條件，分別在0、2、4、6、8、10、12 h 測(cè)定，根據(jù)峰面積值，分別計(jì)算樣品中一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春的平均含量變化。結(jié)果顯示，一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春的平均含量分別為226.57和31.49 μg/g，RSD分別為1.38%和1.63%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品溶液6份(批號(hào)190201)，制備成6份適宜濃度的供試品溶液，按照2.2項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定各自一枝蒿酮酸和(R,S)-告依春的含量。結(jié)果顯示，6份同一批次樣品中一枝蒿酮酸的平均含量為 226.32 μg/g，RSD為1.25%；(R, S)-告依春的平均含量為32.27 μg/g，RSD為2.08%，表明該方法有良好的重現(xiàn)性。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的板青蒿顆粒(批號(hào)190201)樣品約6.0 g，共15份，置于100 mL容量瓶中，平均分為5組，每組分別精密加入濃度為600 μg /mL的一枝蒿酮酸對(duì)照品溶液1.8、2.25、2.7 mL和濃度為120 μg /mL的(R, S)-告依春對(duì)照品溶液1.42、1.13、1.7 mL，用80%甲醇溶解并定容至刻度，密塞，精確稱定重量，超聲30 min，放冷，稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，微孔濾膜濾過(guò)。取濾液，按照2.2項(xiàng)下的色譜條件，各取20 μL注入色譜儀進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，3組樣品中一枝蒿酮酸的平均加樣回收率分別為98.4%、97.9%和98.1%，RSD分別為1.31%、1.02%和1.33%；3組樣品中(R,S)-告依春的平均加樣回收率分別為98.8%、98.3%和97.5%，RSD分別為0.56%、0.88%和1.14%，均符合相關(guān)要求。

表2 加樣回收率(n=5)Tab 2 Recovery test data sheet

2.10 耐用性

2.10.1 不同色譜柱耐用性試驗(yàn) 取供試品溶液(批號(hào)190201)，制備成適宜濃度，按照2.2項(xiàng)下的色譜條件，分別用SUPELCO ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex Prodigy ODS-3V C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)和Thermo Scientific ODS C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm) 三個(gè)不同廠家的色譜柱，每個(gè)色譜柱進(jìn)樣2次，測(cè)定一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。同一供試品在更換不同色譜柱下進(jìn)行測(cè)定，一枝蒿酮酸的RSD為0.90%；(R, S)-告依春的RSD為1.27%。結(jié)果表明該方法對(duì)不同廠家的色譜柱耐用性良好。

表3 不同色譜柱耐用性試驗(yàn)Tab 3 Serviceability test of different chromatographic column

2.10.2 不同分析人員耐受性試驗(yàn) 取供試品溶液(批號(hào)190201)，制備成適宜濃度，按照2.2項(xiàng)下的色譜條件，由實(shí)驗(yàn)室3位分析人員每人制備1份供試品溶液，在同一色譜儀上各自操作測(cè)定自己制備樣品中一枝蒿酮酸和(R,S)-告依春的含量，每人進(jìn)樣2次，記錄峰面積，計(jì)算6次測(cè)定含量變化，結(jié)果見(jiàn)表4。3人6次測(cè)定同一樣品的一枝蒿酮酸RSD為0.85%；(R,S)-告依春的RSD為1.43%，表明該方法在不同分析人員間的耐受性良好。

表4 不同分析人員的耐受性實(shí)驗(yàn)Tab 4 Serviceability test of different analysts

2.11 樣品檢測(cè) 取三批中試樣品(批號(hào)190201、190202、190203)，按以上確定的高效液相色譜法，每批次取樣兩份進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算平均含量，結(jié)果見(jiàn)表5。通過(guò)對(duì)3批次中試樣品含量分析，一枝蒿酮酸的含量在224.66～229.28 μg/g之間；(R, S)-告依春的含量在30.95～33.40 μg/g之間，因此將蒿板青顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量限量暫定為：一枝蒿酮酸的含量不得低于220 μg/g；(R, S)-告依春的含量不得低于30 μg/g，待以后通過(guò)對(duì)多批次的樣品分析后，再科學(xué)地確定其限量。

表5 樣品含量測(cè)定Tab 5 Content determination results of 3 batches of samples

3 討論與結(jié)論

3.1 含量測(cè)定方法的選擇 蒿板青顆粒的原處方為人用藥復(fù)方一枝蒿顆粒，而復(fù)方一枝蒿顆粒是在常用中藥復(fù)方板藍(lán)根顆粒(成分：板藍(lán)根、大青葉)的基礎(chǔ)上，加入具有清熱解毒的維藥新疆一枝蒿組方，經(jīng)過(guò)水提醇沉、濃縮、加工制粒而成，該標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有有效物質(zhì)含量測(cè)定方法。現(xiàn)有研究資料表明，新疆一枝蒿中含有黃酮類、倍半萜類、苷類、揮發(fā)油、生物堿等，其中一枝蒿酮酸是主要有效成分，具有顯著的抗炎、抗病毒活性[9]。大青葉中的主要活性成分有靛藍(lán)、靛玉紅等；板藍(lán)根中的主要活性成分有靛藍(lán)、靛玉紅及核苷類成分，這些成分具有抗病毒、消炎抑菌、抗氧化等藥理活性[10]。已有報(bào)道采用高效液相色譜法測(cè)定新疆一枝蒿、復(fù)方一枝蒿制劑中有效物質(zhì)一枝蒿酮酸、大青葉中的有效成分靛玉紅和板藍(lán)根中的有效物質(zhì)(R, S)-告依春[11-14]。2017版《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)瘙簚中藥卷》中板藍(lán)根注射液含量測(cè)定指標(biāo)成分為(R, S)-告依春。我們前期藥學(xué)研究表明，大青葉、板藍(lán)根中的靛藍(lán)、靛玉紅在藥材和制劑提取、制備及貯藏過(guò)程中穩(wěn)定性差，不適合做為指標(biāo)成分控制質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)蒿板青顆粒制備工藝特點(diǎn)及獸藥質(zhì)量控制要求，以新疆一枝蒿的有效物質(zhì)一枝蒿酮酸和板藍(lán)根中的有效物質(zhì)(R, S)-告依春為指標(biāo)成分，研究建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定蒿板青顆粒中一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春的方法，并對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行了系統(tǒng)的考察，結(jié)果表明該方法操作簡(jiǎn)便，一枝蒿酮酸在24～120 μg/mL范圍內(nèi)；(R, S)-告依春在4.8～24 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，方法準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性和耐用性均能達(dá)到檢測(cè)要求。

3.2 樣品前處理方法的選擇 試驗(yàn)表明，一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春告依春易溶于甲醇，我們采用不同濃度的甲醇溶液超聲提取，并考察了超聲時(shí)間和提取次數(shù)，結(jié)果顯示以80%甲醇溶液超聲提取30 min，可以將樣品中的一枝蒿酮酸與(R, S)-告依春提取完全。

3.3 流動(dòng)相的優(yōu)選 本處方由三味藥材組成，所含成分復(fù)雜，待測(cè)指標(biāo)成分一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春化學(xué)結(jié)構(gòu)和極性存在巨大差異。經(jīng)采用不同比例的甲醇：0.4%磷酸水溶液和乙腈：0.4%磷酸酸水溶液等度洗脫，均不能實(shí)現(xiàn)待測(cè)物質(zhì)和雜質(zhì)的有效分離，峰型對(duì)稱性差，檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，并且以甲醇：0.4%磷酸水溶液洗脫，一枝蒿酮酸色譜峰拖尾明顯。為此，以乙腈：0.4%磷酸為洗脫劑，采用二元高效液相色譜，對(duì)線性洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)選，最終選擇的方法為：流動(dòng)相為乙腈(A)-0.4%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0 min，5% A；0～10 min，5% A→15% A；10～25 min，15% A→30% A；25～40 min，30% A；40～41 min，30% A→5% A；41～45 min，5% A)，檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫35 ℃。在該色譜條件下，(R, S)-告依春的保留時(shí)間在9 min左右，一枝蒿酮酸的保留時(shí)間在36 min 左右，理論塔板數(shù)均大于3000，陰性樣品對(duì)應(yīng)時(shí)間附近無(wú)吸收峰，待測(cè)物質(zhì)和雜質(zhì)間得到很好分離。

研究建立的高效液相色譜法測(cè)定新獸藥蒿板青顆粒中有效物質(zhì)一枝蒿酮酸與(R, S)-告依春含量的方法，結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，為進(jìn)一步控制新藥蒿板青顆粒的質(zhì)量提供了理論依據(jù)。