H3K4me3對豬卵母細胞體外成熟和早期胚胎發育的影響

曾毅仁，張彩玉，侯晗琦，惲雪丹，李湘萍

亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西大學，南寧 530004

哺乳動物卵母細胞發育過程中經歷了大量的表觀遺傳修飾． 其中，組蛋白修飾確保了卵子發生過程中基因的正確表達，平衡了合子基因組的轉錄激活． H3K4me3精確地調控了卵子發生的起始，動態地控制著早期胚胎的發育． 組蛋白H3K4me3對調控基因活化和發育功能有重要作用，在胚胎干細胞中調控重要的多能性相關基因的表達．

我們的前期研究[1]表明，H3K4me3在豬卵母細胞成熟過程中均有表達，說明H3K4me3在豬卵母細胞成熟階段起到了重要的調控作用． 通過敲除Cxxc1基因降低H3K4me3的表達，不利于組蛋白變體的交換，降低了基因組的可接近性和卵母細胞中整體的轉錄活性[2]． 敲除卵母細胞中編碼H3K4甲基化酶或去甲基化酶的基因，會導致減數分裂進程受損，包括生發泡破裂延遲，紡錘體組裝和染色體分離錯誤，極體排出率降低． 很多研究都表明環境的改變會影響表觀遺傳修飾． Wu等[3]研究表明，小鼠IVF(體外受精)早期胚胎中H3K4me3的表達模式與體內受精胚胎的十分相似，但體內受精胚胎中H3K4me3的表達顯著高于IVF 胚胎，采用TSA(曲古抑菌素A)處理之后，IVF胚胎中的H3K4me3表達顯著上調，說明培養條件和環境不同會改變組蛋白修飾． 因此，豬卵母細胞體外成熟效率和質量低于體內，可能是由于表觀遺傳修飾的改變所致． Sha等[4]研究表明，SN(環繞核仁)染色質構型的卵母細胞比NSN(非環繞核仁)構型的卵母細胞具有更好的發育潛能，H3K4me3表達水平在SN染色質構型的卵母細胞中高于NSN構型[4]． 因此，適當提高H3K4me3的表達有利于卵母細胞的體外成熟和早期胚胎的發育．

本試驗通過在豬卵母細胞體外成熟培養液中添加CPI-455，調控卵母細胞組蛋白甲基化及其相關基因的表達，以探討組蛋白H3K4me3在卵母細胞體外成熟及胚胎發育過程中的重要作用．

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用卵巢均來源于廣西南寧本地屠宰場． 試驗所用胚胎為孤雌胚胎．

1.2 試驗方法

1.2.1 豬GV(生發泡)期卵母細胞的獲取與體外成熟

用預熱好的生理鹽水將卵巢清洗干凈后，用10 mL注射器抽取3～8 mm的卵泡液，靜置15 min后，在顯微鏡下挑選3層以上卵丘細胞的卵丘-卵母細胞復合體． 將COCs(卵丘-卵母細胞復合體)清洗干凈后，移入成熟培養液中培養． 0～22 h將卵母細胞放入含有激素的培養液中培養，(22～44] h將卵母細胞移入另一個不含激素的培養液中繼續培養． 試驗組添加不同濃度的CPI-455處理．

1.2.2 豬卵母細胞的孤雌激活

試驗前將融合儀的參數設置為80 μs，50 V/mm和3次脈沖，并在培養箱中平衡電激活液和胚胎培養液． 清洗融合槽，將卵母細胞在激活液中清洗3遍后在激活槽中進行電激活． 激活過的卵母細胞移入平衡好的胚胎培養液中，放入培養箱平衡15 min，然后移入覆蓋有礦物油的胚胎培養液微滴中培養． 24 h統計胚胎分裂率，48 h統計4-細胞率，7 d統計囊胚率．

1.2.3 囊胚細胞總數的鑒定

將囊胚細胞放入4%的多聚甲醛中固定12 h，然后移入10 μg/mL Hoechst33342染色液中，避光室溫染色10 min． 用PBS(磷酸緩沖鹽溶液)將囊胚細胞清洗干凈后，移入載玻片的抗淬滅劑中，用凡士林封片，在熒光顯微鏡下進行觀察并做好試驗記錄．

1.2.4 細胞免疫熒光

收集不同時期的卵母細胞和孤雌囊胚，用4%多聚甲醛固定后在室溫下用1% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)透化30 min，之后用1% BSA(牛血清蛋白)進行非特異性位點封閉1～2 h，封閉后用T-BSA-PBS(吐溫20-BSA-PBS)洗3次，之后放入H3K4me3的一抗中4 ℃ 12 h． 然后將樣品放入培養箱孵育30 min，再用T-BSA-PBS清洗3遍，放入裝有二抗的EP(Eppendorf)管中，避光孵育1.5 h，然后用清洗液清洗3遍，最后用10 μg/mL Hoechst33342復染10 min，放入滴有抗淬滅劑的玻片上，凡士林封片鏡檢．

1.2.5 樣品的微量反轉錄和qRT-PCR(實對熒光定量聚合酶鏈式反應)檢測

收集不同時期的豬卵母細胞和孤雌囊胚，清洗干凈后移入裝有細胞裂解液的EP管中并于-80 ℃冰箱保存． 微量反轉錄按照試劑盒說明書進行操作，反轉錄得到的樣品存放于-20 ℃備用． 將反轉錄得到的產物作為模板，進行qRT-PCR檢測，觀察不同處理組基因的表達情況(表1)． 反應程序為：95 ℃進行5 min，95 ℃進行30 s，60 ℃進行1 min，共40個循環． 豬的18S作為內參基因，目的基因的相對表達量用2-ΔΔCT法計算，引物設計和試驗方法參考文獻[1]和文獻[5]．

表1 qRT-PCR反應引物序列

1.3 統計與分析

本試驗結果均使用SPSS 22.0軟件進行分析，早期胚胎發育率先通過反正弦變化后再進行分析． 每個試驗重復至少3次，每次重復試驗中至少隨機挑選10個以上卵母細胞進行試驗．p<0.05表示差異具有統計學意義，p>0.05表示差異不具有統計學意義．

2 試驗結果

2.1 0～22 h CPI-455處理對豬卵母細胞體外成熟及早期胚胎發育的影響

如表2所示，在豬卵母細胞體外成熟0～22 h過程中添加不同濃度的CPI-455處理，發現5 μmol/L處理組的第一極體排出率顯著高于未處理組、1 μmol/L組和10 μmol/L組(88.80% vs 78.88%，79.23%，78.91%，p<0.05)． 各組之間的胚胎分裂率、4-細胞率均無顯著差異(p>0.05)． 5 μmol/L處理組的囊胚率顯著高于未處理組(41.44% vs 28.35%，p<0.05)，與1 μmol/L和10 μmol/L組之間差異不具有統計學意義(p>0.05)． 各組之間囊胚細胞總數差異不具有統計學意義(p>0.05)．

表2 體外成熟0～22 h過程中添加CPI-455對豬卵母細胞體外成熟和胚胎發育的影響

2.2 (22～44] h與0～44 h采用CPI-455處理對豬卵母細胞體外成熟和早期胚胎發育的影響

如表3所示，在豬卵母細胞體外成熟(22～44] h過程中添加不同濃度的CPI-455處理，發現各組之間第一極體排出率、4-細胞率和囊胚細胞總數差異不具有統計學意義(p>0.05)． 5 μmol/L處理組的胚胎分裂率顯著低于未處理組和1 μmol/L處理組(74.51% vs 84.62%，85.87%，p<0.05)． 如表4所示，豬卵母細胞體外成熟0～44 h添加不同濃度的CPI-455處理時，發現各組之間的第一極體排出率、胚胎分裂率、4-細胞率、囊胚率和囊胚細胞數差異均不具有統計學意義(p>0.05)．

表3 體外成熟(22～44] h中添加CPI-455對豬卵母細胞體外成熟和胚胎發育的影響

表4 體外成熟0～44 h中添加CPI-455對豬卵母細胞體外成熟和胚胎發育的影響

基于以上結果，后續試驗均采用體外成熟0～22 h 添加5 μmol/L處理的方法．

2.3 CPI-455處理對豬卵母細胞和早期胚胎中組蛋白H3K4me3表達的影響

采用免疫熒光技術檢測未處理組和5 μmol/L處理組的GV期、22 h和MⅡ期(成熟)卵母細胞及囊胚中H3K4me3的表達情況． 如圖1、圖2所示，GV期卵母細胞中H3K4me3有表達，兩組中22 h和MⅡ期卵母細胞中未檢測到H3K4me3表達信號． 與未處理組相比，5 μmol/L CPI-455處理組的囊胚中H3K4me3表達顯著提高(p<0.05)．

圖1 CPI-455處理對不同時期豬卵母細胞和囊胚中H3K4me3表達的影響

在相同時期各組之間*表示差異具有統計學意義(p<0.05)． 試驗重復數n=3．圖2 GV期卵母細胞和囊胚中H3K4me3的相對熒光水平

2.4 CPI-455處理對豬卵母細胞和早期胚胎中重要基因表達的影響

采用qRT-PCR方法，檢測CPI-455處理對豬卵母細胞和早期胚胎中相關基因表達的影響，結果如圖3所示． 與未處理組相比，5 μmol/L處理組的22 h卵母細胞中KDM5A和KDM5B的表達均顯著降低(p<0.05)；5 μmol/L處理組的MⅡ期卵母細胞中KDM5A的表達顯著降低(p<0.05)，KDM5B的表達差異不具有統計學意義(p>0.05)；5 μmol/L處理組囊胚中多能性基因Nanog，Oct4，CDX2的表達均顯著提高(p<0.05)．

在相同時期各組之間*表示差異具有統計學意義． 試驗重復數n=3．圖3 CPI-455處理對豬卵母細胞和囊胚中重要基因表達的影響

3 討論與分析

組蛋白修飾是最重要的表觀遺傳修飾之一，在早期胚胎發育中發揮重要作用[6-7]． 組蛋白修飾主要包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，其中組蛋白甲基化在基因表達調控和卵母細胞生長中起重要作用[8]． 組蛋白甲基化受組蛋白甲基化酶和去甲基化酶共同調節，研究表明小鼠卵母細胞中MLL2(H3K4甲基轉移酶)的缺乏會直接導致排卵停止和卵母細胞死亡；在MLL2不足的卵母細胞中，H3K4me2/3的表達降低，導致非正常卵母細胞成熟和異常的基因表達，表明了H3K4me2/3水平對小鼠卵母細胞成熟的重要性[9]． 在小鼠和人類干細胞中，大多數H3K4me3對基因表達的調節是維持基本生物學活性和干細胞多能性的關鍵因素[10]． H3K4me3在囊胚中存在大量表達，說明H3K4me3對胚胎發育和囊胚形成具有重要的調控作用． 尚明保[11]的研究表明，小鼠體內受精胚胎從受精卵到囊胚期的H3K4me3表達水平均高于其在體外受精各期胚胎的表達． 眾多研究結果都表明，H3K4me3對卵母細胞成熟和早期胚胎發育具有重要的調控作用．

在人卵母細胞中H3K4me3呈現出動態表達，從GV期到MII期呈現出逐漸降低的趨勢，合子期到4-細胞期表達升高，8-細胞期表達最低，囊胚期急劇上升[12]． 在豬胚胎中，H3K4me3表達水平從受精卵時期開始下降，到桑椹胚期至最低水平，隨后在囊胚中表達上升[13]． 我們的研究也表明H3K4me3在豬卵母細胞和早期胚胎中呈現出動態表達，但本次試驗在豬卵母細胞成熟22 h和MII期并未檢測到H3K4me3的表達，與沈開元[1]對豬卵母細胞的研究結果不同，究其原因可能是由于成熟培養液成分不同，從而影響了H3K4me3的表達模式．

CPI-455是一種組蛋白去甲基化酶抑制劑，可特異性抑制KDM5A/B的活性，從而提高H3K4me3的整體表達水平． 本試驗在卵母細胞成熟過程中添加CPI-455，抑制了卵母細胞中組蛋白去甲基化酶KDM5A和KDM5B的表達，提高了囊胚中H3K4me3以及相關多能性基因的表達，從而提高了豬卵母細胞體外成熟率和囊胚形成率． 以往的研究也表明，在果蠅卵母細胞中，組蛋白甲基化酶KDM5可調控卵母細胞減數第一次分裂時期中的染色質結構，KDM5缺失會引起H3K4me3表達增加[14]． 通過表達一個顯性失活的組蛋白H3突變體抑制H3K4甲基轉移酶的活性，會使合子基因組激活失敗，損害胚胎的發育[15]，這表明動態的組蛋白甲基化修飾H3K4me3對卵母細胞減數分裂和早期胚胎發育至關重要．