SMYD3對(duì)克隆豬早期胚胎發(fā)育的影響研究

惲雪丹，張 艷，黃時(shí)海，曹麗華，楊 婷，石德順，李湘萍

亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣西大學(xué)，南寧 530004

1997年，Wilmut等[1]通過(guò)利用體細(xì)胞核移植技術(shù)成功地克隆出了世界上第一只體細(xì)胞克隆綿羊多利(Doly)，它的誕生證明了高度分化的體細(xì)胞仍然具有全能性． 自此以來(lái)，許多哺乳動(dòng)物物種已經(jīng)被成功克隆[2]． 目前，體細(xì)胞核移植技術(shù)雖然已取得了明顯進(jìn)展，但還存在克隆效率比較低、克隆動(dòng)物體型偏大、出生的克隆動(dòng)物體不易存活等問(wèn)題．

豬作為一種良好的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，也是最接近人的模式生物，其SCNT(Somatic Cell Nuclear Transfer)的低效率和后代異常限制了其在實(shí)踐中的應(yīng)用[3]． 這些問(wèn)題是由許多原因造成的，目前人們主要的關(guān)注點(diǎn)是體細(xì)胞重編程不完全對(duì)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育的影響[4]． 為了提高SCNT的效率，包括使用不同類型的供體細(xì)胞[5]改善去核程序[6]，延長(zhǎng)從融合到激活的間隔[7-8]等多種方法被用來(lái)調(diào)節(jié)供體細(xì)胞或克隆胚胎的表觀遺傳修飾．

包含SET和MYND域的蛋白質(zhì)3(SMYD3)是一種組蛋白H3賴氨酸4甲基轉(zhuǎn)移酶，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用． 多年來(lái)研究者在某些癌細(xì)胞系中研究了SMYD3的表達(dá)，在卵母細(xì)胞[9]和胚胎中的作用也逐漸被揭示． Bai等[10]發(fā)現(xiàn)SMYD3基因能夠提高牛成纖維細(xì)胞iPSCs誘導(dǎo)效率，具有體細(xì)胞重編程作用． 而在早期胚胎發(fā)育中，SMYD3也具有重要的作用[10-12]． 本研究采用RNA干擾(RNAi)和過(guò)表達(dá)等技術(shù)方法，通過(guò)調(diào)控德保豬耳成纖維細(xì)胞SMYD3基因的表達(dá)，探討其在豬體細(xì)胞核移植過(guò)程中的重編程作用，為提高豬體細(xì)胞克隆效率奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材 料

細(xì)胞：德保豬耳緣成纖維細(xì)胞來(lái)自廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，293T細(xì)胞和豬顆粒細(xì)胞來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室，卵母細(xì)胞抽取自南寧屠宰場(chǎng)提供的豬卵巢．

質(zhì)粒：pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA來(lái)自南京金斯瑞生物科技有限公司，其他所用質(zhì)粒均來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室． 豬SMYD3基因shRNA序列為(5′-CTCGAGCCGGCCACAAGCGAGAATGCAAATTCAAGAGATTTGCATTCTCGCTTGTGGTTTTTTGGCGGCCGC-3′)．

試劑：X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent(Roche公司)；Trizol Reagent(Invitrogen公司)；DNA聚合酶、qRT-PCR試劑盒(Takara公司)；普通質(zhì)粒提取試劑盒、DNA Markers(天根生化科技有限公司)；TransIntreTM EL Transfection(全式金生物技術(shù)有限公司)． 無(wú)特殊說(shuō)明的其余實(shí)驗(yàn)試劑均來(lái)源于SIGMA公司．

引物：克隆及定量引物由上海生工公司合成(表1)．

表1 實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR引物

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

在前期實(shí)驗(yàn)中我們已分別將pSicoR-GFP-1864和pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后觀察發(fā)現(xiàn)空白組細(xì)胞無(wú)綠色熒光蛋白表達(dá)，pSicoR-GFP-1864陰性對(duì)照組和pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA處理組細(xì)胞均有綠色熒光表達(dá)． 72 h后收集細(xì)胞，提取總RNA，qRT-PCR結(jié)果顯示與空白組和陰性對(duì)照組相比，SMYD3基因在處理組細(xì)胞中表達(dá)顯著降低(p<0.05)，SMYD3基因shRNA干擾效率為54%．

利用轉(zhuǎn)染試劑將本實(shí)驗(yàn)室預(yù)先構(gòu)建好并經(jīng)酶切鑒定的過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒pLVX-IRES-ZsGreen1-SMYD3以及干擾重組質(zhì)粒SMYD3-GFP-shRNA分別與包裝質(zhì)粒NRF、包膜質(zhì)粒VSVG以5∶3∶2的比例轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)72 h后收集病毒．

將豬成纖維細(xì)胞以相同的細(xì)胞數(shù)接種到24孔板中，當(dāng)24孔板內(nèi)的細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，向每孔DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培養(yǎng)基里加入病毒以及終質(zhì)量濃度為8 μg/mL的助感染試劑polybrene． 加入MOI(Multiplicity of Infection)值為5的過(guò)表達(dá)SMYD3基因病毒細(xì)胞作為上調(diào)SMYD3組，加入MOI值為0.8的shRNA病毒作為下調(diào)SMYD3組，未處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照組．

1.3 豬卵母細(xì)胞體外成熟

用75%酒精對(duì)保溫取回的卵巢進(jìn)行消毒，再用33 ℃生理鹽水清洗2～3遍，用10 mL無(wú)菌注射器抽取直徑為3～6 mm的卵泡，在體式顯微鏡下用撿卵針撿出有3層以上卵丘細(xì)胞的卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合物(Cumulus oocyte complexes，COCs)． 把撿出的COCs轉(zhuǎn)移到提前預(yù)熱的PM(Pericyte Medium)成熟培養(yǎng)盤，放入38 ℃，5% CO2，100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．

1.4 卵母細(xì)胞孤雌激活

將培養(yǎng)44 h的COCs吸出，放到提前預(yù)熱含0.1%透明質(zhì)酸酶的CCM(Cell Culture Medium)中輕輕吹打，挑選出含極體的成熟裸卵，將裸卵放入電融合槽融合和激活，激活參數(shù)為100 V(以每1 mm電激槽寬計(jì))、80 μs、3次電脈沖． 激活后的裸卵移到胚胎培養(yǎng)液PZM-3中，在38 ℃，5% CO2，100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞、16細(xì)胞和囊胚．

1.5 核移植

分別培養(yǎng)未處理、過(guò)表達(dá)SMYD3基因和抑制SMYD3基因表達(dá)的5～7代豬成纖維細(xì)胞作為供體． 成熟的卵母細(xì)胞如1.3相同方法去除顆粒細(xì)胞后，在鏡下采用盲吸法去核． 吸取表面圓滑、形態(tài)規(guī)則的供體，然后注入卵母細(xì)胞卵周隙內(nèi)(對(duì)于上調(diào)和下調(diào)SMYD3基因表達(dá)的成纖維細(xì)胞需在熒光顯微鏡下挑選綠色熒光蛋白表達(dá)的細(xì)胞作為供體)． 將重構(gòu)卵進(jìn)行電激活，融合/激活參數(shù)為83 V(以每1 mm電激槽寬計(jì))，100 μs，1次直流脈沖． 將融合/激活完的重構(gòu)卵轉(zhuǎn)移到PZM-3(Porcine Zygote Medium-3)中，放到38 ℃，5% CO2，100%濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)． 以不同供體進(jìn)行的核移植，分為對(duì)照組、過(guò)表達(dá)SMYD3組、抑制SMYD3組．

1.6 微量反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR

按試劑盒說(shuō)明提取各組細(xì)胞RNA后，在PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄條件為25 ℃ 10 min，42 ℃ 90 min，95 ℃ 10 min． 以微量反轉(zhuǎn)的cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)，定量引物序列見(jiàn)表1，反應(yīng)體系見(jiàn)表2，反應(yīng)條件參照說(shuō)明書． 內(nèi)參基因是18S，依據(jù)2-ΔΔCT方法計(jì)算SMYD3，Nanog和Oct4基因的表達(dá)情況．

表2 qRT-PCR反應(yīng)體系

2 結(jié) 果

2.1 SMYD3基因在體外成熟豬卵母細(xì)胞和早期胚胎中的表達(dá)模式

qRT-PCR結(jié)果顯示，SMYD3基因在豬卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中表達(dá)較低，顯著低于孤雌激活(囊胚除外)和核移植早期胚胎表達(dá)水平(p<0.05)．SMYD3基因在MII期和GV(Germinal Vesicle)期表達(dá)水平差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；在孤雌激活早期胚胎中，SMYD3基因表達(dá)從2細(xì)胞期開始升高，4細(xì)胞期最高，隨后降低，呈現(xiàn)出先升高再降低的表達(dá)趨勢(shì)(圖1)．SMYD3基因在豬核移植早期胚胎中也呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(shì)，4細(xì)胞期表達(dá)量低于2細(xì)胞期，但差異不顯著(p>0.05)，隨后在8細(xì)胞期達(dá)到最高，然后降低(圖2)．

上標(biāo)不同字母表示相同時(shí)期各組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)．圖1 SMYD3基因在豬卵母細(xì)胞成熟和孤雌早期胚胎發(fā)育中的表達(dá)

上標(biāo)不同字母表示相同時(shí)期各組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)．圖2 SMYD3基因在體細(xì)胞核移植早期胚胎發(fā)育中的表達(dá)

2.2 調(diào)控豬成纖維細(xì)胞SMYD3基因表達(dá)對(duì)體細(xì)胞核移植早期胚胎發(fā)育的影響

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，核移植胚胎的2細(xì)胞分裂率在各實(shí)驗(yàn)中差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)． 上調(diào)SMYD3組核移植胚胎的4細(xì)胞率顯著高于對(duì)照組[(45.6%±1.65%) vs (42%±0.56%)，p<0.05]，下調(diào)組4細(xì)胞率與對(duì)照組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)． 與對(duì)照組相比，上調(diào)SMYD3組核移植胚胎的囊胚率顯著提高[(14.6%±0.96%) vs (9.6%±0.19%)，p<0.05]，下調(diào)組囊胚率顯著降低[(6.7%±0.71%) vs (9.6%±0.19%)，p<0.05](表3)．

表3 調(diào)控SMYD3基因表達(dá)對(duì)豬體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，上調(diào)組SMYD3基因表達(dá)水平在2細(xì)胞和4細(xì)胞期胚胎中顯著提高(p<0.05)，下調(diào)組SMYD3基因檢測(cè)不出． 上調(diào)組2細(xì)胞期胚胎的SMYD3基因表達(dá)顯著高于4細(xì)胞期(p<0.05)(圖3)．

圖3 SMYD3基因在體細(xì)胞核移植2細(xì)胞和4細(xì)胞期中的表達(dá)水平

2.3 調(diào)控SMYD3基因表達(dá)對(duì)豬核移植囊胚多能性基因表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，上調(diào)SMYD3組囊胚的Nanog和Oct4基因表達(dá)水平顯著提高(p<0.05)． 下調(diào)組囊胚中Nanog基因檢測(cè)不出，Oct4基因表達(dá)低于對(duì)照組，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)(圖4)．

圖4 豬體細(xì)胞核移植囊胚Oct4和Nanog基因表達(dá)水平

3 分析討論

近年來(lái)，體細(xì)胞核移植產(chǎn)生的動(dòng)物克隆效率低，胚胎表型異常和生存能力低被認(rèn)為是供體核的重編程不完全所致． 起初Bourc’his 等[13]通過(guò)免疫熒光來(lái)跟蹤染色體上的整體基因組甲基化變化，結(jié)果顯示在受精的牛體細(xì)胞核移植胚胎中植入前甲基化具有與自然繁殖的哺乳動(dòng)物胚胎相似的模式，但其甲基化動(dòng)力學(xué)過(guò)程有著不同程度的紊亂． 而Dean等[14]對(duì)小鼠、豬和牛的比較研究中進(jìn)一步印證了哺乳動(dòng)物中甲基化的保守性與體細(xì)胞移植胚胎甲基化的異常． 之后研究者利用亞硫酸氫鹽分析法對(duì)這種異常的甲基化進(jìn)一步分析表明，在牛核移植桑葚胚和囊胚與牛體外受精胚胎相比DNA甲基化水平較高，水平與供體細(xì)胞DNA甲基化類似[15]． 同樣在身為大動(dòng)物的豬中，研究者也發(fā)現(xiàn)與IVF(In Vitro Fertilization)早期胚胎相比，發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基化水平在核移植早期胚胎中異常[16]，H3K36me3在豬體細(xì)胞核移植早期，即胚胎1細(xì)胞時(shí)期不能被完全去甲基化[17]． 在核移植早期胚胎中DNA和組蛋白甲基化水平異常，而體細(xì)胞重編程不完全造成了這些異常的甲基化水平．

多年研究表明，SMYD3能通過(guò)使染色體組蛋白H3K4發(fā)生二甲基化、三甲基化或抑制H4K5/H4K20的甲基化，來(lái)改變?nèi)旧|(zhì)的可及性以及影響下游多種功能基因，從而參與抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖等生命活動(dòng)過(guò)程． Bai等[10]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SMYD3基因可提高牛胎兒成纖維細(xì)胞iPSCs誘導(dǎo)效率，證實(shí)其具有促進(jìn)牛體細(xì)胞重編程的作用． 而下調(diào)SMYD3基因表達(dá)對(duì)斑馬魚、小鼠和牛胚胎發(fā)育具有不利影響，證明SMYD3基因?qū)ε咛グl(fā)育有重要作用[9-12]． 因此，本文先分析了SMYD3基因在豬卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)在豬卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中SMYD3基因表達(dá)無(wú)顯著性差異，這與前人對(duì)多數(shù)哺乳動(dòng)物的研究相符合． 而體外成熟過(guò)程中SMYD3基因表達(dá)低于孤雌激活(囊胚除外)和核移植早期胚胎發(fā)育過(guò)程，這種表達(dá)模式不同于牛來(lái)源細(xì)胞中的研究，本文推測(cè)這種差異性來(lái)自于獲得早期胚胎的方式不同，或存在物種差異．SMYD3基因在孤雌激活和核移植早期胚胎發(fā)育中均呈現(xiàn)出先升高后降低的表達(dá)趨勢(shì)，卻分別在4細(xì)胞期和8細(xì)胞期達(dá)到峰值，說(shuō)明SMYD3基因參與兩者發(fā)育過(guò)程中的時(shí)間存在差異． 早期胚胎發(fā)育到4細(xì)胞至8細(xì)胞期，正處于大批合子型基因轉(zhuǎn)錄時(shí)期，這種狀態(tài)將一直持續(xù)到早期囊胚；而8細(xì)胞期階段胚胎正處于母型調(diào)控向合子型調(diào)控轉(zhuǎn)變的時(shí)期，也是在離體培養(yǎng)過(guò)程中需要克服發(fā)育阻斷現(xiàn)象的時(shí)期，涉及早期胚胎發(fā)育基因的適時(shí)激活，瞬時(shí)表達(dá)、定位或消失等基因調(diào)控機(jī)制． Li等[18]對(duì)豬孤雌胚胎與體外受精胚胎發(fā)育過(guò)程中的染色質(zhì)重編程進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)孤雌胚胎在合子基因組激活的4細(xì)胞時(shí)期存在特殊的染色質(zhì)區(qū)室解體過(guò)程．SMYD3在上述階段的表達(dá)差異，提示其在調(diào)控胚胎重編程的過(guò)程中應(yīng)有重要作用．

Oct4基因在4～8細(xì)胞期被激活，被認(rèn)為是在早期發(fā)育過(guò)程中參與第1次細(xì)胞命運(yùn)決定，使細(xì)胞發(fā)育為滋養(yǎng)層或保留一部分全能細(xì)胞的關(guān)鍵因子． 第2次命運(yùn)決定出現(xiàn)在囊胚期，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)部分保持亞全能性，部分分化為原始胚層，Nanog在這時(shí)期起決定作用[19]． 兩者作為多能性標(biāo)志因子，其表達(dá)水平對(duì)早期胚胎重編程具有重要作用． 前人研究表明，下調(diào)SMYD3基因表達(dá)在小鼠IVF囊胚中抑制Nanog和Oct4等多能性基因表達(dá)[9]． Bai等[10]在牛IVF胚胎中下調(diào)SMYD3基因表達(dá)會(huì)出現(xiàn)發(fā)育阻滯的現(xiàn)象，能顯著促進(jìn)8細(xì)胞期胚胎Nanog基因表達(dá)，對(duì)OCT4基因無(wú)顯著影響． 本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了豬核移植囊胚Nanog和Oct4基因表達(dá)情況，其中下調(diào)SMYD3組囊胚Nanog基因檢測(cè)不出，證明下調(diào)SMYD3基因可以抑制Nanog基因表達(dá)．Nanog基因表達(dá)水平較低難以檢出，與小鼠研究結(jié)果相符，與牛研究結(jié)果不同，推測(cè)原因可能是胚胎時(shí)期或來(lái)源不同所造成的結(jié)果差異；與對(duì)照組相比，下調(diào)SMYD3組囊胚OCT4基因無(wú)顯著差異，與小鼠研究結(jié)果不同，推測(cè)存在物種差異． 上調(diào)SMYD3基因表達(dá)促進(jìn)囊胚中Nanog和Oct4基因表達(dá)，初步說(shuō)明SMYD3基因促進(jìn)了豬核移植早期胚胎的重編程，具有促進(jìn)豬體細(xì)胞重編程的作用．

4 結(jié) 論

1)SMYD3基因在豬卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中表達(dá)較低，在孤雌激活和核移植早期胚胎發(fā)育過(guò)程中均呈現(xiàn)出先升高后降低的表達(dá)模式．

2) 上調(diào)SMYD3基因表達(dá)可提高豬體細(xì)胞克隆的囊胚發(fā)育率，促進(jìn)Nanog和Oct4基因表達(dá)提高核移植胚胎體外發(fā)育能力．