Wnt/β-catenin信號通路及骨髓間充質干細胞源性外泌體在溫和灸聯(lián)合骨髓間充質干細胞移植促進大鼠肛門括約肌修復中的作用*

金文琪，李 鵬，周蒙恩，朱 影，郭修田

（上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院肛腸外科，上海 200071）

肛門失禁（anal incontinence）是指有機體由于各種原因引起的不能隨意液體或固體糞便排出，嚴重影響患者生活質量的一種難治性疾病[1-3]。導致肛門失禁的原因可分為神經(jīng)源性損傷和肌源性損傷，肌源性損傷在日常生活中更為常見，肛門括約肌損傷為其中最普遍的一種[4]。生理學認為肛門括約肌由內外兩層環(huán)形的括約肌構成，兩者共同協(xié)調維持肛管的閉合功能[5]。屬不隨意肌的內括約肌產(chǎn)生的壓力占肛管靜息壓的70%～80%，以維持肛管在靜息狀態(tài)的閉合功能，屬隨意肌的外括約肌可在外界條件不允許排便的情況下收縮以閉合肛門[6]。因此，任何一種括約肌的損傷均會導致大便失禁。

針對肛門括約肌損傷，間充質干細胞移植可能是修復括約肌損傷最有前景的方法之一[7-9]。間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）為成體干細胞亞組，其不僅可以分化為內皮細胞、上皮細胞、角化細胞、成纖維樣細胞等，還可通過旁分泌機制分泌一些生物活性因子或外泌體以促進內源性細胞的增殖與遷移，從而協(xié)同促進創(chuàng)面血管新生，上皮再生與創(chuàng)面重塑，最終達到創(chuàng)面修復的目的[10-13]。近期研究表明，MSC旁分泌是其發(fā)揮作用的重要方式[14-18]。其中最受關注的是可溶性蛋白分泌和細胞外膜泡（EVS），MSC可以通過釋放胞外膜泡（EVS）影響局部微環(huán)境中其它細胞的活動[19-21]。外泌體屬于細胞外泌微泡的亞型，其膜性結構主要起源于細胞內膜，直徑為介于30～150 nm，廣泛存在于幾乎所有組織，細胞間隙和體液中，在細胞與細胞間信息交流和機制調控中啟到重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，外泌體主要通過其膜上和膜內物質發(fā)揮作用，間充質干細胞來源的外泌體在關節(jié)損傷修復，組織再生，創(chuàng)傷修復等方面發(fā)揮關鍵作用[22]。BMSC作為MSC中眾多分類中的一種，因其分化程度較低，更接近原始干細胞而受到廣泛青睞。

溫和灸屬于艾卷灸之懸起灸的一種，是將艾條燃著的一端與施灸部位的皮膚保持1寸左右距離，使患者有溫熱而無灼痛的一種方法[23]。目前研究發(fā)現(xiàn)，溫和炙可以促進混合痔術后的組織修復，緩解術后疼痛和肛門水腫，促進創(chuàng)面愈合[24-25]。在大鼠肛門括約肌損傷模型中，筆者發(fā)現(xiàn)溫和炙可以促進間充質干細胞的歸巢效應進而介導肛門括約肌的修復，并發(fā)現(xiàn)在移植間充值干細胞來源的外泌體后，相比于單純手術組，損傷組織中的Wnt信號顯著激活，從而明確了間充質干細胞通過分泌外泌體促進了肌細胞的增殖和肛門括約肌組織的修復。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑 健康Srague-Dawley雌性大鼠16只，年齡約12周，體質量200～250 g，SPF級，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供 [許可證號：SCXK（滬）2012-0002]，飼養(yǎng)溫度 25°C，濕度 50%。大鼠適應性喂養(yǎng)1周后用于本實驗，在整個實驗過程中嚴格遵守上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院動物倫理委員會標準條例。艾條購自上海市針灸經(jīng)絡研究生經(jīng)營部，為福元牌7 mm無煙艾條。Real-Time PCR材料：引物合成購自上海生工生物工程公司；RNA提取液 TRIzol購自 Invitrogen公司；PrimeScript RT Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒，SYBR Premix Ex Tag II（Tli RNaseH Plus） 試劑盒購自TaKaRa公司。SD大鼠間充質干細胞和小鼠間充質干細胞培養(yǎng)與鑒定材料：胰蛋白酶，胎牛血清購自Gibico公司；BD Falcon細胞篩，抗CD34、CD45單克隆抗體購自BD公司。免疫印跡材料：兔抗Wnt4，兔抗Wnt5a，兔抗Wnt5b，兔抗DKK3購買自 Abcam，細胞裂解液RIPA購買自Solarbio。外泌體抽提試劑盒exoEasy Maxi Kit購自UL。

1.2 實驗分組與模型建立 將16只SD大鼠隨機等分為溫和炙組，干細胞組，溫和炙聯(lián)合干細胞組、生理鹽水組，每組4只。肛周備皮后所有大鼠均采用Zutshi提出的大鼠肛門括約肌復合體損傷模型：腹腔內注射水合氯醛（300 mg/kg）麻醉大鼠，在解剖顯微鏡下進行后位縱行切除3 mm×1 mm×1 mm肛門括約肌復合體。術后用布比卡因（0.5 mg/kg）注射鎮(zhèn)痛，每天2次，共1 d。

1.3 BMSC分離、培養(yǎng)及鑒定 處死大鼠后取股骨，0.01 mol/L PBS沖洗干凈后采用細胞濾膜篩選細胞，加入1 mL 0.25%胰酶置于37℃消化；顯微鏡下觀察細胞出現(xiàn)收縮時棄去胰酶，更換1 mL DMEM-10%FBS培養(yǎng)基吹打細胞20次，按1∶2比例傳代，加入新鮮DMEM-10%FBS培養(yǎng)基置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；200×g離心細胞懸液5 min，獲取沉淀以適當體積0.01 mol/L PBS緩沖液重懸至移植所需的細胞密度。流式細胞儀采用陰性選擇法進行鑒定，取第三代生長狀態(tài)良好細胞，0.25%胰酶消化，4℃離心，1 000 r/min，5 min，用 1× PBS（含 1%BSA）清洗細胞3次，計數(shù)細胞，加入單克隆抗體CD34、CD45。同時每管樣品設立同型陰性對照。

1.4 治療方式 溫和灸治療：在距肛門約5 cm處進行行溫和灸，每日1次，每次30 min。干細胞治療：采用尾靜脈注射干細胞0.1 mL PBS/次（含107個干細胞），每日1次。生理鹽水注射：采用尾靜脈注射0.1 mL生理鹽水，每日1次。所有大鼠均連續(xù)進行14 d。

1.5 檢測括約肌組織Wnt4、Wnt5a、Wnt5b表達 分別采用Western blot、qPCR檢測蛋白表達。Western blot步驟：提取組織蛋白，配置SDS-PAGE膜，轉膜，TBST漂洗 1 h，5%BSA封閉 2 h，加入一抗（1 μL兔抗Wnt4，1 μL 兔抗 Wnt5a，1 μL 兔抗 Wnt5b），4 ℃過夜，TBST漂洗1 h，二抗孵育封，TBST漂洗1 h，顯影。qPCR步驟：采用按試劑盒說明書用q PCR方法檢測括約肌細胞內Wnt4、Wnt5a、Wnt5b mRNA表達。每個樣品的定量進行3次重復，相對mRNA水平用actin為內參采用－△△CT值算法。

1.6 BMSC源性外泌體分離 待培養(yǎng)的BMSC細胞融合度接近70%，去培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)48 h，收集上清，利用外泌體抽提試劑盒exoEasy Maxi Kit（QIAGEN）進行分離提取，提取后電鏡鑒定，CD63/CD81檢測，BCA試劑盒定量。

1.7 成肌細胞C2C12與外泌體共培養(yǎng)及功能檢測將 C2C12 細胞與 5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL 的外泌體共培養(yǎng)48 h，利用CCK8和EDU試劑盒（Ribobio）檢測細胞增殖，利用流式細胞儀檢測C2C12的細胞周期和凋亡。

2 結果

2.1 BMSC生長與形態(tài)特征 采用倒置相差顯微鏡觀察分離的細胞，結果發(fā)現(xiàn)其符合大鼠骨髓間充質干細胞的形態(tài)特征：細胞貼壁生長，呈長梭形；早起呈多個散在的細胞集落，此為均勻分布的BMSC簇狀增殖灶，細胞排列呈似漩渦狀；生長后期細胞增殖良好，排列緊密（圖 1）。

圖1 間充質干細胞形態(tài)特征

2.2 Western blot和 qPCR 檢測 Wnt4、Wnt5A、Wnt5B蛋白表達 Wnt/β-catenin信號通路在組織損傷與修復機制中作用顯著。在前期溫和灸聯(lián)合間充質干細胞移植可協(xié)同促進大鼠損傷肛門括約肌結構和功能恢復的基礎上，為進一步探索此種協(xié)同修復效果是否與Wnt/β-catenin信號通路相關，在治療14 d后剝離各組大鼠肛門括約肌，進行qPCR和Western blot檢測各組肛門括約肌組織中wnt蛋白的表達差異，結果顯示溫和灸聯(lián)合 BMSCs移植可促進 Wnt4、Wnt5A、Wnt5B高表達（圖2A，B）。因此，溫和灸聯(lián)合間充質干細胞可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路從而促進對損傷肛門括約肌組織的修復作用。

圖2 A.qPCR分析各組樣本中WNT4,WNT5A,WNT5B RNA表達B.Western blot分析各組樣本中WNT4,WNT5A,WNT5B蛋白的表達

2.3 BMSC源性外泌體鑒定 為分析及驗證所抽提外泌體質量及性狀，采用掃描電鏡分析BMSC源性外泌體形態(tài)及直徑，結果顯示BMSC源性外泌體粒徑分布在80～140 nm，符合外泌體粒徑特征（圖3A）；Western blot檢測外泌體表面標記蛋白CD63和CD81呈顯著富集；符合外泌體膜表面蛋白標記特征（圖3B）。根據(jù)上述結果可證實富集到的是骨髓間充質干細胞源性外泌體。

圖3 A.掃描電鏡分析外泌體形態(tài)及粒徑;B.Western blot分析間充質干細胞和外泌體中CD63和CD81表達

2.4 成肌細胞C2C12與外泌體共培養(yǎng)及功能檢測EDU結果顯示在25 μg/mL的BMSC源性外泌體作用下C2C12細胞處于細胞分裂期的數(shù)量顯著上升（圖4A，B）。采用CCK8檢測BMSC源性外泌體對小鼠成肌細胞C2C12增殖的作用，結果顯示BMSC源性外泌體可顯著促進C2C12細胞增殖，增殖效果隨著外泌體濃度增加而逐步提升（圖4 C）。為進一步明確作用機制，將BMSC源性外泌體與C2C12細胞共培養(yǎng)，Western blot結果顯示可顯著抑制Cleaved Caspase3和BAX表達，并顯著上調BCL2表達（圖4 D）。證實BMSC源性外泌體可促進C2C12成肌細胞的增殖并抑制其凋亡。為進一步分析BMSC源性外泌體對C2C12細胞周期及凋亡的影響，流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)BMSC源性外泌體可顯著促進C2C12細胞S期和G2期（圖5A，B）。與對照組相比，BMSC源性外泌體可以顯著抑制C2C12細胞凋亡（圖5C-D）。因此，間充質干細胞源性外泌體可能通過調控C2C12細胞周期以促進增殖并抑制其凋亡作用。

圖4 A-B.EDU檢測間充質干細胞來源外泌體對C2C12細胞增殖的促進作用;C.CCK8分析不同濃度充質干細胞來源外泌體對C2C12細胞增殖的促進作用;D.Western blot分析間充質來源外泌體對凋亡抑制蛋白Bcl-2,凋亡促進蛋白BAX和Cleaved Caspase3的表達影響

圖5 A-B.間充質干細胞來源外泌體對C2C12細胞周期的影響；C-D.間充質干細胞來源外泌體對C2C12細胞凋亡的影響

3 討論

干細胞具有增殖及多向分化潛能，強大的旁分泌機制，在組織工程學領域研究廣泛。許多研究證實BMSC移植可促進不同組織的修復與再生，從而改善損傷組織的功能[26-30]。隨著越來越多干細胞修復組織的基礎實驗的涌現(xiàn)，許多結直腸外科醫(yī)師也將其應用于損傷肛門括約肌的修復中，采用不同的大鼠肛門括約肌損傷模型，不同的細胞移植方式，企圖尋找一種最適于括約肌修復的移植方法。Salccedo等[31]首次建立大鼠損傷肛門括約肌模型，將BMSC移植后檢測大鼠肛門括約肌組織修復情況，發(fā)現(xiàn)干細胞移植可顯著促進大鼠損傷的肛門括約肌組織結構的恢復。Trébol等[32]獨創(chuàng)一種最新的大鼠肛門括約肌損傷模型，并采用與之前干細胞移植不同的方法——生物縫合技術，也發(fā)現(xiàn)生物縫合技術能夠安全有效的促進肛門括約肌的修復。Bisson等[33]將同系的成肌細胞注射在冷凍損傷的大鼠括約肌內及損傷邊緣，發(fā)現(xiàn)成肌細胞可分化為成熟肌纖維，在60 d后肛壓可顯著增高并與正常組無顯著差異，并發(fā)現(xiàn)注射在創(chuàng)面邊緣與創(chuàng)面中心效果相同。干細胞移植可作為一種微創(chuàng)的治療方式用于損傷肛門括約肌組織的修復。

溫和灸不僅在臨床研究中療效顯著，在很多基礎實驗也表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢。基礎實驗研究證實在大鼠慢性難愈性創(chuàng)面的局部及雙側腎俞、足三里施以溫和灸治療后，創(chuàng)面修復初期和中期可增加肉芽組織中VEGF的表達，從而促進血管新生，改善創(chuàng)面血流，在修復后期可抑制血管新生，縮短創(chuàng)面愈合時間，提高愈合質量[34]。在創(chuàng)面修復的初期與中期，溫和灸還可提高創(chuàng)面的巨噬細胞數(shù)，平衡膠原產(chǎn)生與降解，調節(jié)創(chuàng)面Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的比例，防止瘢痕形成，提高創(chuàng)面愈合質量[35]。溫和灸可顯著改善大鼠肛瘺術后感染性創(chuàng)面局部微循環(huán)，有效調控創(chuàng)面VEGF及CD34的表達，加速創(chuàng)面愈合[36]。因此，溫和灸以其“以溫促通”的功效可促進創(chuàng)面修復。因此，前期研究將溫和灸與骨髓間充質干細胞移植聯(lián)合應用于大鼠損傷肛門括約肌，發(fā)現(xiàn)兩者具有協(xié)同作用，可顯著促進大鼠肛門括約肌組織結構和功能的統(tǒng)一恢復[37]。

Wnt/β-catenin信號通路在組織的穩(wěn)態(tài)及發(fā)生發(fā)展過程中至關重要[38]，Wnt蛋白在胚胎發(fā)育及成體組織中是一類可調節(jié)干細胞自我更新、分化及細胞間交流的分泌型蛋白，它可促進上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞等創(chuàng)面細胞的增殖、凋亡、分化等多種生物學過程，許多關于干細胞對創(chuàng)面修復的研究認為這種恢復效果均是通過不同的Wnt蛋白以激活Wnt經(jīng)典通路從而發(fā)揮作用的[39-40]。成肌細胞在缺乏β-catenin時會導致延遲分化，而在具有持續(xù)活化的β-catenin時可停止生長并產(chǎn)生分化，證實Wnt/β-catenin信號通路在肌源性干細胞向骨骼肌分化過程中起重要作用[41]。骨髓間充質干細胞已被證實可促進組織修復及再生，但是目前仍不清楚它是如何調節(jié)下游的Wnt信號的。不僅如此，研究證實大量wnt配體在組織急性損傷后高表達，包括 wnt3a、wnt4、wnt5a、wnt10a、wnt11[42]。

前期研究證實溫和灸可促進間充質干細胞的歸巢，溫和灸聯(lián)合骨髓間充質干細胞移植對括約肌結構和功能的恢復具有協(xié)同作用。但這種聯(lián)合方式的療效通過激活何種信號通路發(fā)揮療效仍未可知。因此，本文主要探索溫和灸聯(lián)合骨髓間充質干細胞移植是否通過調節(jié) 3 種 Wnt相關蛋白（Wnt4、Wnt5A、Wnt5B）中的一種或多種以激活Wnt/β-catenin信號通路從而發(fā)揮對大鼠損傷肛門括約肌的修復效果。創(chuàng)面成肌細胞為肌肉損傷修復過程中的關鍵細胞，為進一步明確骨髓間充質干細胞外泌體創(chuàng)面成肌細胞的作用，因此采用體外研究BMSC源性外泌體對成肌細胞C2C12的影響，證實可調控C2C12細胞周期，促進其增殖，抑制凋亡。

4 結論

綜上所述，溫和灸聯(lián)合間充質干細胞移植可能通過兩方面促進大鼠損傷肛門括約肌組織修復。一方面可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路以發(fā)揮修復效果，另一方面可能通過調控成肌細胞C2C12的細胞周期促進其增殖并抑制凋亡從而促進局部肌組織細胞的再生、增殖促進組織修復。