宮腔粘連內(nèi)膜纖維化進展與TGF-β1/Smads信號通路的相關(guān)性研究*

牛紅萍，姜麗娟，張永會，彭強麗，詹興秀，秦光貴，胡紅娟

（1.云南中醫(yī)藥大學，云南 昆明 650500；2.云南省中醫(yī)醫(yī)院/云南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650021）

子宮是產(chǎn)生月經(jīng)、接受胚胎著床并生長發(fā)育的場所，為一肌性空腔器官，可隨女性不同時期生理現(xiàn)象發(fā)生不同改變。當宮腔遭受感染，或直接機械性創(chuàng)傷，可導致子宮內(nèi)膜瘢痕化修復，出現(xiàn)宮腔、宮頸管不同程度的粘連、閉塞，臨床稱為宮腔粘連（intrauterine adhesion，IUA）。1948年Asherman對IUA進行了癥狀、診斷等的詳細報道，故又稱Asherman綜合征[1]。IUA主要臨床表現(xiàn)為月經(jīng)過少，可伴或不伴經(jīng)行腹痛，甚至閉經(jīng)；主要危害是不孕、自然流產(chǎn)、復發(fā)性流產(chǎn)、胚胎種植反復失敗等不良妊娠結(jié)局，以及胎盤植入、胎盤殘留等產(chǎn)科并發(fā)癥。創(chuàng)傷和感染是導致IUA的兩大主要病因，但迄今為止，IUA確切的發(fā)病機制仍在探索中，對其防治以及改善妊娠結(jié)局仍是生殖醫(yī)學的瓶頸問題。目前大多學者認為IUA是一種子宮內(nèi)膜纖維化疾病。TGF-β1/Smads信號通路是調(diào)控組織器官纖維化的經(jīng)典通路，而中醫(yī)藥對該信號通路有調(diào)節(jié)作用[2]。因此，筆者團隊通過調(diào)取本院IUA患者子宮內(nèi)膜病理切片，采用蘇木素-伊紅（HE）染色檢測腺體計數(shù)、Masson染色檢測纖維化程度，免疫組化法（IHC）檢測與TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)的TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 表達，進行回顧性分析，明確TGF-β1/Smads信號通路與IUA發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，為進一步臨床防治研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2018年1月-2019年5月因人工流產(chǎn)、診斷性刮宮、自然流產(chǎn)清宮術(shù)后出現(xiàn)月經(jīng)量少、閉經(jīng)、痛經(jīng)、不孕、自然流產(chǎn)等在云南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院（云南省中醫(yī)醫(yī)院）婦科就診患者，經(jīng)宮腔鏡檢查證實為IUA，并按照納入標準納入病例30例（輕、中、重各10例）；非IUA患者10例，為同期因?qū)m內(nèi)膜增厚行宮腔鏡下診刮術(shù)，且內(nèi)膜組織病檢證實為子宮內(nèi)膜單純性增生。納入標準：參照2015年中國宮腔粘連診斷分級評分標準，宮腔鏡確診為IUA，評分為1～20分，其中0～5分為輕度粘連；6～10分為中度粘連；11～20分為重度粘連。排除標準：子宮內(nèi)膜結(jié)核、子宮發(fā)育畸形；合并有黏膜下肌瘤、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、乳腺癌等惡性腫瘤；有血栓性疾病。所有患者自愿加入研究并簽署知情同意書。本實驗研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，倫理文件批號：YNSZLL-AF-004-2020/03。

1.2 主要實驗儀器及試劑 Thermo EXCELSIOR AS全自動脫水機（上海）；BM-Ⅷ生物組織包埋機；Thermo FINESS E+半自動切片機CS-Ⅵ型攤片烤片機；Nikon Ci顯微鏡（日本）；OPLENIC DIGITAL CAMERR圖像采集軟件（四川西隴科學）；Motic MedA數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)（四川西隴科學）；兔抗人Smad2/3/7一抗（Bios）；兔抗人 TGF-β1（Bios）；免疫組化顯色試劑（DaKo）；抗體稀釋液（福州邁新生物技術(shù)）；封閉羊血清（福州邁新生物技術(shù)）。

1.3 方法 所有組織標本按照常規(guī)標準操作步驟進行洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、貼片、烤片。各組內(nèi)膜組織HE染色及Masson染色后，采用Motic MedA數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)顯微鏡下觀察，每張切片選10個高倍視野（HE：200×；Masson：200×）。HE染色用于檢測內(nèi)膜腺體計數(shù)，Masson染色用于檢測各組子宮內(nèi)膜纖維化面積。IHC檢測與TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)的 TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7表達水平情況。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 結(jié)果評定標準 IHC結(jié)果評定標準：陽性表達為棕黃色。陰性表達為無著色。參照文獻[2]制定結(jié)果評分標準。根據(jù)陽性細胞的百分率分別給予1～5分：1分：陽性率為1%～10%；2分：陽性率為11%～25%；3分：陽性率為分26%～50%；4分：陽性率為51%～75%；5分：陽性率為76%～100%。Masson染色結(jié)果評定標準：膠原纖維呈藍色。細胞質(zhì)、肌纖維和紅細胞為紅色。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，計量資料均以表示。對于正態(tài)分布，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗，2組組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單方差分析；對于非正態(tài)數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)檢驗方法，組內(nèi)比較采用威爾-科克森符號秩檢驗，2組組間比較采用曼-惠特尼U檢驗，多組組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗；顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 腺體計數(shù) 非粘連組腺體豐富，呈圓形或長橢圓形。粘連組腺體稀少。與非粘連組比較，粘連組腺體計數(shù)明顯下降，差異顯著（P＜0.001），且與粘連程度呈負相關(guān)。見表1、圖1。

圖1 子宮內(nèi)膜HE染色（200×）

2.2 子宮內(nèi)膜膠原纖維面積比 非粘連組藍染區(qū)域不明顯，膠原纖維面積小。粘連組可見明顯藍染區(qū)域，膠原纖維面積廣泛。與非粘連組比較，粘連組膠原纖維面積明顯增加，差異顯著（P＜0.001），且與粘連程度呈正相關(guān)。見表1、圖2。

圖2 子宮內(nèi)膜Masson染色（200×）

表1 各組子宮內(nèi)膜腺體計數(shù)、內(nèi)膜纖維化面積（±s，n=10）

表1 各組子宮內(nèi)膜腺體計數(shù)、內(nèi)膜纖維化面積（±s，n=10）

注：與非粘連組比較，△P＜0.001；與輕度IUA組比較，▲P＜0.05。

組別 腺體計數(shù)（個/H P） 纖維化面積（%）非粘連組 4 8.1 3±6.5 5 0.4 8 9±0.2 4 1輕度I U A組 2 4.8±2.1 5△ 1 2.9 2±5.0 5 4△中度 I U A 組 1 8.7±1.3 4△▲ 2 5.8 2±2.6 3 6△▲重度 I U A 組 1 2.1±2.0 8△▲ 3 2.5 0±6.9 6 9△▲

2.3 IHC檢測各組子宮內(nèi)膜組織中TGF-β1、Smad2/3/7的表達 TGF-β1在粘連組、非粘連組子宮內(nèi)膜腺上皮和間質(zhì)均有表達，但主要表達于腺上皮細胞。與非粘連組比較，IUA組TGF-β1高表達，并與粘連程度呈正相關(guān)，差異顯著（P＜0.01）。Smad2在粘連組、非粘連組子宮內(nèi)膜腺上皮細胞和間質(zhì)細胞均有表達，與非粘連組比較，粘連組Smad2呈高表達，差異顯著（P＜0.01），但與粘連程度無明顯相關(guān)（P＞0.05）。Smad3在非粘連組中主要表達于腺上皮，在粘連組中腺上皮、間質(zhì)均有表達。與非粘連組比較，粘連組呈高表達，差異顯著（P＜0.01），并與粘連程度呈正相關(guān)。Smad7在腺上皮、間質(zhì)中均有表達。在非粘連組中，Smad7高表達，在粘連組中呈低表達。與非粘連組比較，差異顯著（P＜0.01），并與粘連程度呈負相關(guān)。見表2、圖 3-圖 6。

表2 各組子宮內(nèi)膜TGF-β1、Smad2/3/7免疫組化評分（x ± s，n=10）

圖3 子宮內(nèi)膜TGF-β1免疫組化染色（200×）

圖4 子宮內(nèi)膜Smad2免疫組化染色（200×）

圖6 子宮內(nèi)膜Smad7免疫組化染色（200×）

圖5 子宮內(nèi)膜Smad3免疫組化染色（200×）

3 討論

人子宮內(nèi)膜由黏膜上皮、腺體、間質(zhì)和血管等組成，可分為功能層和基底層。功能層占據(jù)子宮內(nèi)膜的上三分之二，可隨著卵巢激素的調(diào)控周期性的增殖和脫落，形成規(guī)律月經(jīng)，接受胚胎植入。基底層主要由基質(zhì)以及豐富的大血管等組成，是子宮內(nèi)膜的生發(fā)區(qū)域，其完整性和連續(xù)性對內(nèi)膜的再生及修復起著決定性的作用。生理情況下，子宮內(nèi)膜可無痕化再生及修復[3]。人工流產(chǎn)負壓吸引術(shù)，稽留流產(chǎn)清宮術(shù)、葡萄胎清宮術(shù)、產(chǎn)后胎盤殘留清宮術(shù)、人流不全清宮術(shù)，診斷性刮宮術(shù)、子宮內(nèi)膜病變切除是常見的宮腔手術(shù)，也是目前公認引起IUA的常見病因[4-5]。

盡管目前一致認為子宮內(nèi)膜損傷是引起IUA的主要病因，但迄今為止，其確切發(fā)病機制尚不清楚。文獻表明，子宮內(nèi)膜組織細胞因子、酶、受體、蛋白、微RNA、基因、干擾素-γ（IFN-γ）等異常表達參與了 IUA的發(fā)生發(fā)展。就細胞因子而言，白介素-18（IL-18）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、TGF-β1、胰島素樣生長因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子核因子-κB（NF-κB）、結(jié)締組織生長因子（CTGF）、血小板源性生長因子 BB（PDGF-BB）以及堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）高表達參與了IUA發(fā)生發(fā)展[6-10]。IFN-γ是Th1細胞的特異性因子，研究表明IFN-γ在粘連組織及粘連旁內(nèi)膜組織的低表達參與了IUA的形成。酶的異常主要與基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）低表達有關(guān)[11-12]。但有研究認為MMP-9表達上調(diào)參與了IUA的形成[13]。受體異常與Toll樣受體4、雌激素受體高表達、生長激素受體低表達有關(guān)[14-16]。蛋白異常主要與骨橋蛋白、鋅指蛋白Snail、Smad2/3蛋白的高表達有關(guān)[17-18]。微RNA主要與miR-29、miR-665低表達有關(guān)[19]。此外叉頭框F2（Fox F2）高表達亦參與了IUA的發(fā)生[20]。

轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一類參與細胞生長、分化調(diào)節(jié)等多種生理功能的細胞因子。目前哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三個亞型，均由 112 個氨基酸組成，具有70%～82%的同源性，生物學作用相似。機體內(nèi)幾乎所有正常及病理組織均能合成釋放某種TGF-β家族成員，并表達該家族成員的膜結(jié)合受體，但其中以TGF-β1活性最強[21-22]。TGF-β1是迄今發(fā)現(xiàn)的最強致纖維化因子，且在纖維化疾病發(fā)病過程中起核心作用，能和成纖維細胞當中的特異性受體相結(jié)合，實現(xiàn)對多條信號傳導通路的激活。Smads蛋白家族是其下游激活蛋白，可介導細胞外信號經(jīng)膜受體致細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導。TGF-β1/Smads信號通路是經(jīng)典的纖維化信號通路，由 TGF-β1、TGF-β1受體（TGF-βR）、Smads蛋白家族以及調(diào)控基因等組成。TGF-β1通過與受體結(jié)合激活信號轉(zhuǎn)導至下游Smads家族。在TGF-βR 中，TGF-βRⅠ和 TGF-βRⅡ為結(jié)構(gòu)相似的單次跨膜糖蛋白和跨膜的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，是TGF-β1信號傳導的主要受體[23-24]。Smads蛋白家族根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能特性分為受體調(diào)節(jié)Smads（RSmads）、共同通路性Smads（Co-Smads）和抑制性Smads（I-Smads）三類。Smad2/3 是 TGF-β1 信號下傳的首個信號分子，屬于R-Smads。Smad4是信號通路必需的轉(zhuǎn)運分子，可將信號轉(zhuǎn)至胞核，在核內(nèi)調(diào)節(jié)各基因的轉(zhuǎn)錄屬Co-Smads。Smad7可與Smad2或Smad3競爭結(jié)合 TGF-β1受體，阻斷 Smad2或Smad3被磷酸化及轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)，抑制TGF-β1信號轉(zhuǎn)導，起負調(diào)節(jié)作用，屬于I-Smads[25-27]。

任何事件致子宮內(nèi)膜基底層損傷造成的上皮細胞及間質(zhì)細胞再生受阻、血管新生障礙、成纖維細胞增生，以及細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成與降解失衡等，均可引起纖維結(jié)締組織增殖[28]。文獻[29-30]表明TGF-β1在子宮內(nèi)膜、宮腔液中均分布廣泛，可通過旁分泌或自分泌作用，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細胞的增殖、分化、凋亡；對細胞外基質(zhì)的合成、創(chuàng)傷的修復、免疫功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。研究[31-32]表明無論是IUA術(shù)后創(chuàng)面滲出液中，還是子宮內(nèi)膜組織中TGF-β1水平均顯著升高，認為其參與了IUA的發(fā)生發(fā)展。與此同時，研究[33-34]發(fā)現(xiàn)在重度粘連內(nèi)膜組織中，TGF-β1、Smad4、Smad3 表達明顯上調(diào)，而Smad7表達明顯下調(diào)，且TGF-β1與Smad4、Smad3呈正相關(guān)，與Smad7則呈負相關(guān)；在TGF-β1/Smad信號通路中，Smad3正調(diào)控過度和Smad7負調(diào)控不足可能促進了IUA的形成。本研究結(jié)果顯示，IUA組腺體稀少，纖維化面積廣泛，且纖維化面積與粘連程度呈正相關(guān)；IHC檢測結(jié)果顯示，IUA組 TGF-β1、Smad3、Smad2表達明顯上調(diào)，Smad7表達明顯下調(diào)，差異顯著（P＜0.01），且其中 TGF-β1、Smad3與粘連程度呈正相關(guān)，Smad7與粘連程度呈負相關(guān)，而Smad2與粘連程度無明顯相關(guān)，與目前研究具有一致性。綜上，纖維化進展參與了IUA的發(fā)生發(fā)展，且內(nèi)膜組織纖維化程度與粘連程度呈正相關(guān)，而TGF-β1/Smad信號通路激活可能參與了IUA內(nèi)膜纖維化。內(nèi)膜纖維化導致內(nèi)膜容受性低下，而目前尚缺乏特意性有效藥物防治內(nèi)膜纖維化，文獻[35]表明中醫(yī)藥對該信號通路具有調(diào)節(jié)作用，因此本研究結(jié)果認為TGF-β1/Smad信號通路可作為中醫(yī)藥改善IUA內(nèi)膜纖維化的作用靶點。但由于本研究樣本量小，主要以IHC為檢查手段，因此仍需進一步深入研究，但目前IHC是臨床病理檢測主要措施，且經(jīng)濟適用，因此對臨床仍具有一定價值。