匹伐他汀聯合用藥體外抗HIV-1活性研究*

楊金軒，羅榮華，陳 歡，鄭永唐△

（1.云南中醫藥大學中藥學院，云南 昆明 650500；2.中國科學院昆明動物研究所，中國科學院動物模型與人類疾病機理重點實驗室，云南 昆明 650223）

他汀類藥物是羥甲戊二酰輔酶A還原酶競爭性抑制劑，自美國FDA于1987年批準洛伐他汀上市以來，先后出現了辛伐他汀、氟伐他汀、瑞舒伐他汀、普伐他汀及阿托伐他汀等（化學結構式見圖1），其具有抗氧化、抗炎、調節一氧化氮合成、改善內皮功能等多種藥理作用，主要用于心血管疾病的治療[1-2]。

圖1 他汀類藥物的化學結構式

人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）主要攻擊宿主的CD4+T細胞，引起細胞耗竭、免疫缺陷，最后出現威脅生命的機會性感染。當前治療艾滋病最為有效的方法仍然是聯合抗逆轉錄病毒療法（combined antiretroviral therapy，cART），可以將病毒載量控制在檢測限水平以下、恢復和穩定CD+T細胞的數量、降低炎癥及免疫激活標志物水平，但有研究顯示HIV感染者經cART治療后產生的相關代謝疾病會使心血管疾病風險增加[3-6]。HIV相關的動脈粥樣硬化性心血管疾病涉及的機制是復雜的，不僅與血脂異常、胰島素抵抗及高血壓等傳統因素相關，也和HIV感染產生的慢性炎癥及免疫激活與抑制有關[7-9]。

隨著“發現即治療”策略的出現，使艾滋病從致死性疾病轉變為可以治療但難以治愈的慢性疾病，延長了患者的存活期，HIV感染者老齡化和長期cART治療也勢必增加心血管疾病的患病率。他汀類藥物具有廣泛的抗炎和免疫調節作用，這對HIV感染人群是十分有益的。目前他汀藥物如何調節HIV患者免疫功能的機制尚未完全闡明，有研究顯示他汀類藥物可能具有抗HIV活性[10]。本研究想探尋他汀類藥物的抗HIV活性機制并在體外評價匹伐他汀與其它抗HIV藥物聯合用藥時的聯合抗病毒效應，旨在尋求適宜的聯合用藥方案。

1 材料與方法

1.1 試劑 噻唑藍（3，（4，5-dimethylthiazol-2-yl，噻唑藍）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT）、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、Triton X-100、青霉素、Tween 20和抗IgG Fc抗體（Sigma公司產品）；辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔IgG抗體（KPL公司）；十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）（BioFR0XX 公司）；二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）（VWR Life Science AMRESCO 公司）；硫酸鏈霉素（Solarbio公司）；N，N-二甲基甲酰胺DMF（N，N-dimethylformamine，DMF）（成都市科隆化學品有限公司）；30%過氧化氫（西隴科學股份有限公司）；RPMI-1640和胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）（Gibco公司）；脫脂奶粉（內蒙古伊利實業集團股份有限公司）；抗HIV p24單克隆抗體和兔抗HIV-1 p24多克隆抗體（本實驗室）。

1.2 儀器 離心機（Allegra X-30，Beckman），二級生物安全柜（1287，Thermo），CO2細胞培養箱（3111，Thermo），2～8 ℃冰箱（HYC-360，Haier），-20 ℃冰箱（BCD-196E/D，Haier），-80 ℃冰箱 （386L，－86 ℃，Thermo），酶標儀（800TS，Bioteck），倒置顯微鏡（TS-100F，Nikon）。

1.3 待測化合物及陽性對照藥物 依曲韋林（E－travirine，ETR）（山東大學劉新泳教授饋贈）；雷特格韋（Raltegravir，RAL）（默沙東制藥有限公司）；拉米夫定（Lamivudine，3TC）、齊多夫定（Zidovudine，AZT）、茚地那韋（Indinavir，IDV） 和達蘆那韋（Darunavir，DRV）（大連美侖生物技術有限公司）；恩曲他濱（Emtricitabine，FTC）（北京中碩醫藥科技開發有限公司）；替諾福韋（Tenofovir，TDF）（黃石福爾泰醫藥科技有限公司）；普伐他汀鈉（Pravastatin sodium）、洛伐他汀（Lovastatin）、辛伐他汀（Simvastatin）、瑞舒伐他汀（Rosuvastatin）、阿托伐他汀（Atorvastatin）、匹伐他汀 （Pitavastatin） 和度魯 特韋（Dolutegravir，DTG）（Macklin公司）。

1.4 細胞與病毒 人T淋巴細胞C8166細胞系、實驗株HIV-1IIIB由NIH AIDS Reagent Progrom惠贈。根據常規方法培養制備HIV-1病毒并進行感染性滴度測定，將病毒小量分裝，-80℃保存。C8166細胞培養于含10% FBS的RPMI-1640培養基，實驗前1天進行傳代使細胞處于對數生長期。

1.5 他汀類藥物對C8166細胞的毒性實驗 96孔板內將藥物進行5倍梯度稀釋，共設置6個藥物濃度，每個藥物濃度設 3個復孔（100 μL/孔），同時設置無藥物的陰性對照孔（NC）和空白對照孔（BC）。除BC孔外，每孔加入100 μL的細胞懸液。在37℃，5% CO2培養箱培養3 d，采用MTT法測定化合物對不同細胞的毒性。800TS酶標儀在570/630 nm波長下測定OD值，計算半數細胞毒性濃度（The 50% cytotoxicity concentration，CC50）。

1.6 他汀類藥物對HIV-1IIIB致C8166細胞病變的抑制作用 96孔板內將藥物進行5倍梯度稀釋，共設置6個藥物濃度，每個藥物濃度設3個復孔（100 μL/孔）。每孔加 50 μL C8166 細胞懸液與 50 μL HIV-1IIIB病毒稀釋液（1300 TCID50），同時設置含C8166細胞與病毒的陽性對照孔（PC），置于37℃，5% CO2培養箱內培養。第3天在倒置顯微鏡下（100×）觀察合胞體的形成并計數，計算半數有效濃度（The 50% effective concentration，EC50）[11]。

1.7 他汀類藥物對HIV-1IIIB急性感染C8166細胞中病毒復制的抑制作用 將C8166細胞懸液與HIV-1IIIB病毒液（2000 TCID50）混勻，置 37 ℃感染4 h后加入適量1×PBS緩沖液離心洗滌以便去除游離的病毒，用培養基重懸細胞備用。

96孔板內將藥物進行5倍梯度稀釋，共設置6個藥物濃度，每個藥物濃度設3個復孔（100 μL/孔），同時設置無藥物的陽性對照孔（PC）和空白對照孔（BC）。除BC孔外，每孔加入100 μL上述細胞，輕輕振動混勻，37℃，5% CO2培養箱培養。第3天收集細胞培養上清，用終濃度為5% Triton X-100裂解滅活。采用ELISA測定HIV-1 p24蛋白檢測藥物對HIV-1復制的抑制作用，計算EC50[12-13]。

1.8 匹伐他汀與ETR等9個藥聯合用藥對HIV-1IIIB急性感染C8166細胞中病毒復制的抑制作用 96孔板內，按匹伐他汀、ETR、FTC、AZT、3TC、TDF、DTG、RAL、IDV和DRV單藥對急性感染C8166細胞中抑制 HIV-1IIIB復制的 EC50值，設置 8× EC50、4 × EC50、2 × EC50、EC50、0.5 × EC50、0.25 × EC50、0.125 × EC50、0.0625×EC50共8個藥物梯度，分別設置單藥組和聯合用藥組。將C8166細胞懸液與HIV-1IIIB（2000 TCID50）混勻，在 37 ℃下感染 4 h，1×PBS緩沖液洗滌2次以便去除游離的病毒，用培養基重懸細胞備用。

取上述100 μL細胞接種到含有100 μL不同濃度梯度稀釋化合物的96孔板上，置37℃，5% CO2培養箱培養。第3天收集培養上清，用終濃度為5% Triton X-100裂解滅活。ELISA測定HIV-1 p24蛋白檢測藥物對HIV-1復制的抑制作用，計算EC50。用CompuSyn 軟件計算聯合指數（combination index，CI）和劑量降低系數（dose reduction index，DRI）[14-15]。

2 結果

2.1 他汀類藥物對C8166細胞的毒性 本研究采用MTT法檢測了他汀類藥物對C8166細胞的毒性，發現普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀對C8166 細胞無毒性作用，CC50＞200 μmol·L-1；匹伐他汀和阿托伐他汀對C8166細胞有一定的毒性作用，CC50分別為105.67±1.68、99.49±2.08 μmol·L-1（圖2，表 1）。

圖2 他汀類藥物對C8166細胞的毒性作用

2.2 他汀類藥物的體外抗HIV-1活性 采用合胞體計數和ELISA檢測p24抗原的方法評估了他汀類藥物的體外抗HIV-1活性。研究發現普伐他汀、瑞舒伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀的治療指數未超過10，無抗HIV活性。匹伐他汀經2種方法檢測均有一定的抗病毒效應，EC50分別為5.12±1.44、9.88 ±4.55 μmol·L-1，因此，我們選擇匹伐他汀進行進一步研究（表1）。

表1 他汀類藥物體外抗HIV-1活性（±s，n=2）

表1 他汀類藥物體外抗HIV-1活性（±s，n=2）

注：CC50，半數細胞毒性濃度；EC50，半數有效濃度；TI，治療指數。

E C 50（μ m o l·L-1） T I s y n c y t i u m p 2 4 s y n c y t i u m p 2 4 P r a v a s t a t i n ＞2 0 0 ＞2 0 0 ＞2 0 0 i n a c t i v e i n a c t i v e R o s u v a s t a t i n ＞2 0 0 1 0 5.5 6±3 2.6 1 9 2.3 1±1 7.8 1 ＞1.8 9 ＞2.1 6 P i t a v a s t a t i n 1 0 5.6 7±1.6 8 5.1 2±1.4 4 9.8 8±4.5 5 2 0.6 3 1 0.6 9 A t o r v a s t a t i n 9 9.4 9±2.0 8 2 1.3 3±2.4 2 1 8.6 6±1.4 7 4.6 6 5.3 3 S i m v a s t a t i n ＞2 0 0 1 2.5 1±2.1 4 9 2.4 9±9.2 2 ＞1 5.9 8 ＞2.1 6藥物 C C 50（μ m o l·L-1）L o v a s t a t i n ＞2 0 0 5 9.0 5±0.0 4 9 2.7 7±8.6 8 ＞3.3 8 ＞2.1 6

2.3 匹伐他汀與其它抗HIV藥物的聯合用藥 HIV與心血管疾病風險增加有關，心血管并發性嚴重影響患者的生存質量和預期壽命，可能需服用他汀類藥物的治療。我們發現匹伐他汀除了降血脂外，還有一定的抗HIV-1活性，因此，進一步研究匹伐他汀與其它抗HIV藥物聯合的抗病毒效應。采用周氏中效模型原理設計聯合用藥的實驗方案和數據處理[16-18]，主要評價參數為CI值和DRI值。當CI值＞1.1時，藥物間呈現拮抗作用；0.9≤CI值≤1.1時，藥物間呈現相加作用；CI值＜0.9，藥物間呈現協同作用[19]。DRI值是指達到同一效應時藥物聯用的劑量比藥物單用劑量降低的倍數。DRI值越大，則表明藥物聯合時劑量降低得越多，可降低藥物毒副作用的發生和減緩耐藥病毒株的出現。

結果如表2所示，匹伐他汀與核苷類逆轉錄酶抑制劑（nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NRTIs）TDF、FTC、3TC、AZT 聯合用藥時的聯合指數分別為 0.56±0.14、0.67±0.15、0.69±0.11、0.80±0.12，藥物間呈現協同作用；匹伐他汀與蛋白酶抑制劑（protease inhibitor，PI）IDV和DRV聯合用藥時聯合指數分別為0.76±0.17、0.58±0.15，藥物間呈現協同作用；匹伐他汀與非核苷類逆轉錄酶抑制劑（non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NNRTIs）ETR聯合用藥時的聯合指數為1.18±0.05，藥物間呈現拮抗作用；匹伐他汀與整合酶鏈轉移抑制劑（Integrase strand transfer inhibitors，INSTIs）RAL 和 DTG 聯合用藥時的聯合指數分別為1.03±0.04、1.03±0.02，藥物間呈現相加作用。匹伐他汀與其他抗HIV藥物聯用時，每組單藥的DRI值均＞1，兩藥聯用時劑量比藥物單用劑量降低1.10～14.50倍。

表2 匹伐他汀與不同抗HIV藥物聯合用藥（±s，n=2）

表2 匹伐他汀與不同抗HIV藥物聯合用藥（±s，n=2）

注：CI值，聯合用藥指數；DRI值，劑量降低指數。

E D 50 E D 75 E D 90 E D 95 P i t a v a s t a t i n+T D F P i t a v a s t a t i n 2.9 9±0.9 1 3.3 4±0.5 8 3.7 8±0.1 5 4.1 2±0.2 2 0.5 6±0.1 4 協同T D F 2.3 2±1.0 4 3.1 0±1.3 2 4.1 4±1.6 6 5.0 4±1.9 4 P i t a v a s t a t i n+F T C P i t a v a s t a t i n 9.4 3±7.0 7 9.8 7±3.5 4 1 1.4 4±1.1 6 1 3.4 5±5.4 9 0.6 7±0.1 5 協同F T C 1.5 7±0.3 7 1.6 9±0.4 4 1.8 3±0.5 1 1.9 3±0.5 6 P i t a v a s t a t i n+3 T C P i t a v a s t a t i n 5.1 4±0.5 2 5.7 7±1.9 4 7.0 9±5.0 7 8.5 2±7.8 0 0.6 9±0.1 1 協同3 T C 1.5 6±0.0 4 1.7 9±0.0 5 2.0 6±0.0 7 2.2 6±0.0 8 P i t a v a s t a t i n+A Z T P i t a v a s t a t i n 1 4.3 4±1 2.9 9 8.0 5±3.9 3 5.1 9±0.2 9 4.2 1±1.8 0 0.8 0±0.1 2 協同A Z T 1.1 2±0.1 7 1.4 3±0.3 0 1.8 2±0.4 8 2.1 5±0.6 4 P i t a v a s t a t i n+I D V P i t a v a s t a t i n 2.6 8±0.2 0 4.0 9±0.1 7 6.2 6±0.9 7 8.4 0±1.9 5 0.7 6±0.1 7 協同I D V 1.3 7±0.2 9 1.6 0±0.3 9 1.8 7±0.5 1 2.0 7±0.6 1 P i t a v a s t a t i n+D R V P i t a v a s t a t i n 5.7 5±0.6 3 5.5 6±1.1 8 5.4 1±1.6 9 5.3 3±2.0 2 0.5 8±0.1 5 協同D R V 2.8 8±0.3 1 2.7 4±0.2 0 2.6 5±0.6 6 2.6 2±0.9 6 P i t a v a s t a t i n+E T R P i t a v a s t a t i n 3.1 8±0.0 8 3.8 9±0.2 8 4.7 7±0.5 6 5.4 7±0.8 1 1.1 8±0.0 5 拮抗E T R 1.0 4±0.1 1 1.0 4±0.0 3 1.0 4±0.0 4 1.0 5±0.0 9 P i t a v a s t a t i n+R A L P i t a v a s t a t i n 4.0 5±2.1 4 3.2 7±1.0 0 2.7 2±0.1 8 2.4 5±0.2 5 1.0 3±0.0 4 相加R A L 1.5 2±0.5 6 1.5 1±0.2 9 1.5 3±0.0 0 1.5 6±0.2 0 P i t a v a s t a t i n+D T G P i t a v a s t a t i n 2.0 5±0.4 1 2.1 1±0.6 3 2.1 9±0.8 7 2.2 4±1.0 4 1.0 3±0.0 2 相加藥物 單藥 D R I值 C I值 聯合效果D T G 1.6 0±0.2 3 1.5 7±0.1 3 1.5 5±0.0 3 1.5 4±0.0 4

3 討論

HIV相關的血脂異常和HIV感染者的心血管疾病通常使用他汀類藥物作為初始治療，然而他汀類藥物與PIs、可比西他、依法韋侖會存在藥物相互作用，并且藥物劑量的高低也會影響治療效果，在某種程度上限制了臨床應用[20-21]。HIV相關的心血管疾病日益受到關注，他汀類藥物具有諸多優勢且顯現出越來越多“老藥新用”的功效，如預防淋巴瘤的形成、增強生物或放化療制劑的效果、降低阿爾茲海默癥風險、降低心衰患者的癌癥風險及相關死亡率等[22-24]，需根據藥物間相互作用調整劑量選擇合適的用藥方案充分利用他汀類藥物。

Elahi等[25]研究發現阿托伐他汀通過甲戊二羥酸途徑上調p21，從而抑制HIV-1的復制。本文對幾種他汀類藥物初步篩選之后發現只有匹伐他汀在體外具有抗HIV-1活性作用，但相關的作用機制研究目前尚未完全闡明，有待進一步研究。阿托伐他汀無體外抗病毒活性，與先前報道的結果不一致，可能是由于所選用的細胞系、HIV-1病毒株以及檢測方法不同所導致的。

此外，我們進一步評估了匹伐他汀與其他類抗HIV藥物聯合時所呈現的藥物間相互作用是協同、相加或拮抗。本研究中匹伐他汀是一種羥甲戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，與其它抗HIV藥物作用機制不同，同時鑒于藥物聯合模型應用的簡便高效性，采用周氏中效模型原理設計聯合用藥方案并用相關軟件進行數據處理。當前的cART治療是由2種NRTIs+1種NNRTI或PI或INSTI組成[26]，本研究對臨床治療中常用的9種抗艾滋病藥物與匹伐他汀進行聯合抗HIV-1藥效分析，研究結果顯示匹伐他汀除了與NNRTI-ETR聯用呈現拮抗作用外，與NRTIs、INSTIs、PIs均呈現相加或協同作用。目前他汀類藥物與抗逆轉錄病毒藥物相互作用研究中關于匹伐他汀的支持證據有限，本研究為臨床治療方案的選擇提供了一定的參考價值。