MTHFD2對人肝癌細胞凋亡的影響及其作用機制研究

嚴萬能 馬海潔 樂婷 陳冬冬 李世波 張國強 王婕

肝癌是全球常見的惡性腫瘤之一，其中肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）死亡人數居世界癌癥致死人數第3位，發病率列第6位[1]。隨著近代分子生物學研究的進展，分子靶向治療已成為除手術、放療、化療以外的第4種主要腫瘤治療方式，并且相比傳統化療藥物具有靶向性強和不良反應少的優點。目前索拉非尼和侖伐替尼已成為治療晚期HCC的一線靶向用藥，但其耐藥性導致患者的5年生存率并不理想[2-3]。因此，尋找更加有效的HCC治療靶標有著重要的臨床意義。

在HCC發生、發展過程中，肝臟的一系列特異性代謝功能受損的同時又獲得了新的代謝特征，腫瘤細胞惡性程度隨之升高[4]，其中葉酸循環是主要的代謝失調通路之一[5]。葉酸循環涉及的主要代謝酶有亞甲基四氫葉酸脫氫酶1（methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 1 like,MTHFD1L）、亞甲基四氫葉酸脫氫酶2（methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2,MTHFD2）及絲氨酸羥甲基轉移酶2（serine hydroxymethyl transferase 2,SHMT2）等，其中MTHFD2是一種位于線粒體中的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸依賴性雙功能酶，在線粒體葉酸代謝中呈高表達水平[6]。近年來多項研究表明MTHFD2的過表達可促進乳腺癌、結腸癌、膠質瘤等類型腫瘤的發生和發展，而關于MTHFD2對HCC細胞凋亡進程的影響仍是未知[7-10]。因此，本研究探討MTHFD2對人HCC細胞凋亡的影響及其分子機制，以期為HCC患者的臨床治療研究開辟新的方向。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系與培養方式 人HCC細胞系HepG2和SMMC-7721均來自舟山醫院細胞分子生物實驗室；FBS與胰酶均購自美國Gibco公司，DMEM高糖培養基購自美國Hyclone公司。培養方式為含10%FBS的DMEM高糖培養基于37°C、5%CO2的細胞培養箱內培養，48 h后0.25%胰酶消化傳代。

1.1.2 抗體 兔源單克隆抗體MTHFD2（1∶1 000）、酶原型聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶（Pro PARP）、剪切型聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶（Cleaved PARP）、酶原型半胱天冬酶 3（Pro Caspase-3）、剪切型半胱天冬酶 3（Cleaved Caspase-3）、酶原型半胱天冬酶 7（Pro Caspase-7）、剪切型半胱天冬酶7（Cleaved Caspase-7）、p53正向凋亡調節因子（Puma）、BH3交叉域互作介導蛋白（Bim）、BH3交叉域死亡受體激動蛋白（Bid）、BH3關聯死亡啟動子（Bad）、BH3交叉域互作殺傷蛋白（Bik）、BH3關聯 K 蛋白（Bak）、BH3關聯 X蛋白（Bax）、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗均購自美國Cell Signaling Technology公司；β-actin購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 試劑 MTHFD2-siRNA#1、MTHFD2-siRNA#2、Puma-siRNA、陰性對照劑Ctrl-siRNA均由廣州銳博生物有限公司合成；Lipo3000轉染試劑購自美國Thermo Fisher公司；流式細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；CCK-8檢測試劑盒購自中國Biosharp生物有限公司；ECL檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher公司。siRNA序列如下：MTHFD2-siRNA#1 5'-GGAAGGAG CAGCAGTCATT-3'，MTHFD2-siRNA#2 5'-GGATCAGTATTCCATGTTA-3'；Puma-siRNA 5'-GCCUG UAAGAUACUGUAUA。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組 將對數生長期的HepG2和SMMC-7721細胞隨機分為siMTHFD2#1組、siMTHFD2#2組和siCtrl組3組。各組常規培養24 h，用Lipo3000分別轉染 MTHFD2-siRNA#1、MTHFD2-siRNA#2 及 Ctrl-siRNA。另將對數生長期的SMMC-7721細胞隨機分為siMTHFD2+siPuma組、siMTHFD2組、siPuma組和 siNC組4組，培養24 h后分別進行MTHFD2-siRNA和Puma-siRNA共轉染、MTHFD2-siRNA轉染、PumasiRNA轉染、Ctrl-siRNA轉染。

1.2.2 MTHFD2、凋亡通路相關蛋白、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）家族蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。轉染72 h后收集不同處理組的細胞，RIPA裂解液提取細胞總蛋白。經過10%SDS-PAGE凝膠電泳后，將蛋白轉至0.45 μm PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4°C孵育過夜，TBST洗膜5 min，3次后二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜5 min，3次。ECL發光液孵育，顯影曝光后利用Image J 1.8.0進行灰度分析。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin內參條帶灰度值。實驗重復3次，取平均值。

1.2.3 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術。轉染72 h后收集不同處理組的細胞，預冷PBS洗滌后加入結合緩沖液混勻。每組細胞各加膜粘連蛋白5（Annexin V）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液，室溫避光孵育20 min后流式細胞儀檢測，以Annexin V陽性的凋亡細胞比例作為凋亡率進行統計。實驗重復3次，取平均值。

1.2.4 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8實驗。將轉染72 h后不同處理組的細胞以2×103個/孔種于96孔板，每組設3個復孔，放入細胞培養箱中培養。分別于24、48、72、96 h加入 10%CCK-8試劑，37 °C 培養 2 h后利用酶標儀于450 nm處檢測光密度（OD）值，繪制細胞生長曲線。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 3組HepG2和SMMC-7721細胞中MTHFD2表達水平比較 HepG2和SMMC-7721細胞中siMTHFD2#1組和siMTHFD2#2組的MTHFD2表達水平均明顯低于siCtrl組，差異均有統計學意義（均 P＜0.01），見表 1、圖 1。

圖1 3組HepG2和SMMC-7721細胞中亞甲基四氫葉酸脫氫酶2（MTHFD2）表達的電泳圖

表1 3組HepG2和SMMC-7721細胞中MTHFD2表達水平比較

2.2 3組HepG2和SMMC-7721細胞凋亡率比較 HepG2和SMMC-7721細胞中siMTHFD2#1組和siMTHFD2#2組的細胞凋亡率均明顯高于siCtrl組，差異均有統計學意義（均 P＜0.01），見表 2、圖 2。

圖2 3組HepG2和SMMC-7721細胞凋亡率的流式細胞圖

表2 3組HepG2和SMMC-7721細胞凋亡率比較（%）

2.3 3組HepG2和SMMC-7721細胞凋亡通路相關蛋白表達水平比較 與siCtrl組比較，siMTHFD2#1組和siMTHFD2#2組HepG2和SMMC-7721細胞的Cleaved Caspase3/Pro Caspase3、Cleaved Caspase7/Pro Caspase7 比值均明顯升高，siMTHFD2#1組和siMTHFD2#2組SMMC-7721細胞的Cleaved PARP/Pro PARP比值均明顯升高，差異均有統計學意義（均 P＜0.05）。見圖 3、表 3、4。

表3 3組HepG2細胞凋亡通路相關蛋白表達水平比較

表4 3組SMMC-7721細胞凋亡通路相關蛋白表達水平比較

圖3 3組HepG2和SMMC-7721細胞凋亡通路相關蛋白表達的電泳圖（Pro為酶原型蛋白；Cleaved為剪切型蛋白；PARP為聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶；Caspase-3為半胱天冬酶3；Caspase-7為半胱天冬酶7）

2.4 3組SMMC-7721細胞Bcl-2家族蛋白表達水平比較 與siCtrl組比較，SMMC-7721細胞siMTHFD2#1組和siMTHFD2#2組中Puma表達水平均明顯升高，差異均有統計學意義（均 P＜0.01），3 組 Bim、Bid、Bad、Bik、Bak、Bax表達水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表 5、圖4。

圖4 3組SMMC-7721細胞Bcl-2家族蛋白表達的電泳圖（Bcl-2為B淋巴細胞瘤-2；Puma為p53正向凋亡調節因子；Bim為BH3交叉域互作介導蛋白；Bid為BH3交叉域死亡受體激動蛋白；Bad為BH3關聯死亡啟動子；Bik為BH3交叉域互作殺傷蛋白；Bak為BH3關聯K蛋白；Bax為BH3關聯X蛋白）

表5 3組SMMC-7721細胞Bcl-2家族蛋白表達水平比較

2.5 4組SMMC-7721細胞增殖能力比較 在96 h的時間點，siMTHFD2組OD值低于siNC組，而siMTHFD2+siPuma組的OD值則明顯高于siMTHFD2組，差異均有統計學意義（均 P＜0.01），見表 6、圖 5。

圖5 4組SMMC-7721細胞增殖能力比較（OD為光密度）

表6 4組SMMC-7721細胞增殖能力比較

2.6 4組SMMC-7721細胞凋亡率比較 siMTHFD2組凋亡率高于siNC組，siMTHFD2+siPuma組則明顯低于siMTHFD2組，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表7、圖 6。

圖6 4組SMMC-7721細胞凋亡率的流式細胞圖

表7 4組SMMC-7721細胞凋亡率比較（%）

3 討論

MTHFD2作為線粒體葉酸循壞代謝中的關鍵酶，目前在結腸癌、肺癌、膠質瘤等癌癥中均有其關于細胞增殖、凋亡、耐藥等方面的研究，但目前對HCC細胞凋亡過程中MTHFD2功能及調控機制的探討仍是空白[11-12]。本研究結果發現，敲低MTHFD2表達后人HCC細胞HepG2和SMMC-7721都呈現出明顯的凋亡表型，細胞凋亡關鍵因子Cleaved PARP、Cleaved Caspase-7、Cleaved Caspase-3的表達均被激活，表明敲低MTHFD2表達能促進HCC細胞凋亡。

細胞凋亡是一種細胞的程序化死亡進程，Bcl-2蛋白家族與p53蛋白是多數細胞中重要的凋亡調節因子。Puma屬于Bcl-2蛋白家族BH3亞族，是p53誘導細胞進入凋亡過程中的關鍵下游蛋白，介導由線粒體細胞色素C釋放所激活的內源性凋亡途徑。有研究表明激活p53-Puma-BAX/Bcl-2通路將導致非小細胞肺癌凋亡并抑制細胞生長[13]。本課題組研究發現，敲低MTHFD2表達后HCC細胞的Puma表達水平明顯上升，進一步將Puma表達下調后，MTHFD2敲低所導致的促凋亡現象被明顯抑制，在分子水平上揭示MTHFD2是通過調控Puma表達從而促進HCC細胞凋亡。這可能是由于腫瘤細胞自身的代謝特性使其長時間處于高濃度活性氧的環境中，當活性氧劑量增加則會進一步激活p53蛋白，從而抑制細胞周期，啟動凋亡進程[14]。而MTHFD2能通過平衡葉酸代謝中的氧化還原反應降低活性氧含量，從而抑制了p53-Puma信號軸，最終阻斷腫瘤細胞的凋亡進程[15]。

由于HCC早期診斷、治療和相關基礎研究的發展，其術后生存率已有一定提高，但HCC的整體治療效果仍較差，因此尋找能夠有效阻滯腫瘤細胞惡性進程，進而提高HCC患者生存率的分子靶標也成為了亟待解決的臨床研究課題。Pikman等[16]的研究小組在急性髓系白血病（AML）中的研究中表明，靶向MTHFD2能夠抑制AML細胞生長和集落形成，延長患者生存期。Kawai等[17]研究結果報道，口服的MTHFD2抑制劑DS18561882能夠在小鼠乳腺癌細胞異體移植模型中有效抑制腫瘤的生長。而本研究揭示，MTHFD2敲低后能夠通過下游分子Puma誘導HCC細胞進入凋亡程序，這一研究結果表明MTHFD2具有成為治療HCC有效分子靶標的潛在臨床應用價值。在后續的研究中，本研究團隊將在動物水平和臨床樣本兩方面進行進一步論證，充分解析MTHFD2在HCC中的功能及相關分子機制。

綜上所述，敲低MTHFD2的表達能夠促進HCC細胞凋亡，這可能是通過上調Puma的表達水平來實現的。提示MTHFD2可作為靶點進而應用于臨床HCC治療，為腫瘤患者的臨床治療研究開辟了新的方向。