硫化氫調(diào)控Nrf2-HO-1信號通路對休克大鼠肺損傷的保護(hù)作用

黃朝露 趙曉勇 林麗麗 徐文莉 李海燕

創(chuàng)傷失血性休克是機(jī)體遭遇重大創(chuàng)傷后死亡的主要原因之一[1]。創(chuàng)傷后的大出血、微循環(huán)灌注不足、組織廣泛損傷所導(dǎo)致的后續(xù)炎癥綜合征等均可引起重要臟器功能衰竭。而在后期復(fù)蘇時，缺血-再灌注損傷可進(jìn)一步導(dǎo)致耗氧增加，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強以及線粒體功能障礙[2]。因此如何減輕缺血-再灌注損傷，改善氧化應(yīng)激和炎癥的發(fā)生至關(guān)重要。核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）是具有獨特cap-ncollar區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子，有研究表明，Nrf2可促進(jìn)血紅素加氧酶-1（HO-1）的轉(zhuǎn)錄，對細(xì)胞有保護(hù)作用，在抗氧化應(yīng)激過程中扮演重要角色[3]。硫化氫（H2S）是第3類氣體信號分子，在正常機(jī)體內(nèi)可自行合成，參與機(jī)體各大系統(tǒng)生理、病理過程，有研究證實，H2S對創(chuàng)傷失血性休克具有保護(hù)作用[4-5]。本研究通過觀測外源性H2S硫氫化鈉（NaHS）對Nrf2/HO-1信號通路的作用，探討H2S對創(chuàng)傷失血性休克所致肺損傷的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組 36只SD雄性大鼠由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK（浙）2020-0014。大鼠置于自然光、安靜環(huán)境、室溫（23±2）℃、相對濕度（50±10）%環(huán)境下飼養(yǎng) 48 h以上，隨時可以進(jìn)食、飲水。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為NaHS處理組（NaHS組）、模型組（HTS組）和假手術(shù)組（Sham組），每組12只。

1.2 主要試劑和儀器 NaHS購自美國Sigma公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、髓過氧化物酶（MPO）測試盒均購自南京建成生物研究所；HE染色試劑盒購自北京Solarbio公司；Nrf2、HO-1和GAPDH抗體均購自美國Santa公司；山羊抗兔IgG（H+L）購自美國Abcam公司；醋酸鋅、N,N-二甲基-對苯二胺硫酸鹽、三氯醋酸、三氯化鐵均購自美國Sigma公司。OMRP24組織勻漿機(jī)購自北京鴻苑鑫儀科技有限公司；KDC-2046低速冷凍離心機(jī)購自安徽科大創(chuàng)新股份有限公司；Mini-Proten Tetra System成套電泳系統(tǒng)購自美國BIO-RAD公司；Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fish科技有限公司；RM2235輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)購自上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司；LV-150N光學(xué)顯微鏡購自日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 模型的制備 動物模型的制備參照文獻(xiàn)[6]，所有大鼠禁食過夜，自由飲水，3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，作腹正中切口5 cm后縫合直接造成軟組織創(chuàng)傷。NaHS和HTS組大鼠一側(cè)股動脈留聚乙烯導(dǎo)管放血，另一側(cè)股靜脈插管輸液及股動脈插管連接壓力轉(zhuǎn)換器檢測平均動脈壓（MAP），在10 min內(nèi)迅速放血使MAP維持在40 mmHg左右，此時為最大放血量；回輸40%最大放血容量的林格液維持上述低血壓狀態(tài)90 min，然后以4倍最大放血容量的林格液復(fù)蘇60 min，復(fù)蘇后立即縫合所有傷口。NaHS組在復(fù)蘇前腹腔注射0.5 ml NaHS（28 μmol/kg），HTS 組予等量 0.9%氯化鈉注射液。Sham組僅作腹部切口，不放血、不復(fù)蘇。復(fù)蘇2 h后麻醉大鼠，取動脈血2 ml，3 000 r/min離心10 min，提取上清液凍存?zhèn)溆茫幻擃i處死大鼠后迅速開胸，取雙肺組織備用。

1.3.2 血清H2S濃度及SOD、MDA、MPO水平測定 采用去蛋白方法測定H2S濃度，于血清中加入0.5 ml醋酸鋅形成沉淀，分別加入0.5 ml N，N-二甲基-對苯二胺硫酸鹽和三氯化鐵使之充分顯色，再加入0.5 ml三氯醋酸和2.5 ml蒸餾水使蛋白沉淀，5 000 r/min離心5 min后取上清液在665 nm波長處測吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清中H2S濃度。根據(jù)試劑盒說明書的具體步驟檢測血清SOD、MDA和MPO水平。

1.3.3 肺系數(shù)、肺濕/干重比檢測 肺組織稱重計算肺系數(shù)，肺系數(shù)=大鼠肺質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量×100%。取左肺下葉稱濕重，置于75℃烤箱至恒重計算肺濕/干重比。

1.3.4 肺損傷形態(tài)觀察 將肺組織常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，每組隨機(jī)選取3只大鼠各1張肺組織切片，每張切片隨機(jī)選取3個視野觀察大鼠肺組織的病理改變。

1.3.5 肺組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。在肺組織中加入適量RIPA蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，勻漿后提取蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉，孵育一抗并4℃過夜，TBST漂洗后孵育HRP結(jié)合的二抗，超敏ECL顯色，凝膠成像儀觀察并拍照。Image J測定光密度并分析。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠血清H2S濃度及SOD、MDA、MPO水平比較 與Sham組比較，HTS組H2S濃度及SOD、MDA、MPO水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與HTS組比較，NaHS組H2S濃度及SOD、MDA、MPO水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。見表1。

表1 3組大鼠血清H2S濃度、SOD、MDA、MPO水平比較

2.2 3組大鼠肺系數(shù)、肺濕/干重比比較 與Sham組比較，HTS組肺系數(shù)、肺濕/干重比均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與HTS組比較，NaHS組肺系數(shù)、肺濕/干重比均顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。見表 2。

表2 3組大鼠肺系數(shù)、肺濕/干重比比較

2.3 3組大鼠肺損傷形態(tài)學(xué)比較 HE染色結(jié)果顯示，Sham組肺泡形態(tài)結(jié)構(gòu)基本完整，輪廓清晰，未見病變；HTS組肺泡壁明顯增厚，水腫，炎性細(xì)胞浸潤，部分肺泡壁塌陷；而NaHS組大鼠肺泡水腫和炎性浸潤情況明顯改善。見圖1。

圖1 3組大鼠肺損傷形態(tài)學(xué)比較（HE染色，×200）

2.4 3組大鼠Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平比較 與Sham組比較，HTS、NaHS組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與HTS組比較，NaHS組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。見圖2和表3。

表3 3組大鼠Nrf2、HO-1蛋白相對表達(dá)量

圖2 3組大鼠核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）、血紅素加氧酶-1（HO-1）蛋白表達(dá)的電泳圖（NaHS為硫氫化鈉）

3 討論

創(chuàng)傷失血性休克是由創(chuàng)傷所致機(jī)體有效循環(huán)容量急劇下降，最后發(fā)展為多器官功能障礙的連續(xù)過程，病理、生理過程包括機(jī)體灌注不足、組織器官缺血、缺氧、細(xì)胞代謝障礙、同時產(chǎn)生大量氧自由基等毒性因子使重要器官發(fā)生強烈的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)等。后期的液體復(fù)蘇在增加氧供的同時也造成了再灌注損傷，加劇了“氧供-氧耗”的失衡，氧化應(yīng)激被進(jìn)一步激活[1，7]。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)。正常機(jī)體內(nèi)，氧自由基清除劑主要有SOD、POD和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）；MDA是氧自由基攻擊生物膜產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，因此可以通過檢測以上氧化應(yīng)激指標(biāo)來評價機(jī)體氧化應(yīng)激損傷程度。

H2S作為繼一氧化氮和一氧化碳之后的第3種氣體分子，近些年越來越引人關(guān)注[8-9]，其主要通過提高細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽（GSH）水平來對抗氧化應(yīng)激[10]。Geng等[11]首次提出H2S可通過抗氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕心肌損傷；此外，H2S還可以通過絲裂原活化蛋白激酶信號通路減少活性氧（ROS）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[12]。本研究建立創(chuàng)傷失血性休克動物模型，觀察H2S供體NaHS對機(jī)體創(chuàng)傷早期引起氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。本實驗結(jié)果顯示NaHS組、HTS組肺組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物MDA、MPO水平均明顯高于Sham組，而NaHS組的MDA、MPO水平均明顯低于HTS組。此外，SOD水平檢測和HE染色結(jié)果進(jìn)一步證明了H2S可在創(chuàng)傷失血性休克引起的肺氧化應(yīng)激損傷中起到保護(hù)作用。

Nrf2（由Nfe2l2基因編碼）是主要的真核生物氧化還原活性因子，主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原平衡、保護(hù)性抗氧化和Ⅱ期排毒反應(yīng)，其中包括HO-1和SOD[3，13-14]。近期研究發(fā)現(xiàn)在肺缺血再灌注損傷小鼠中，經(jīng)重組高遷移率族蛋白1（rHMGB1）預(yù)處理可通過Keap1/Nrf2/HO-1途徑抑制氧化應(yīng)激，從而改善肺缺血再灌注損傷；且使用異丁香酚抑制該途徑會加重肺組織損傷和肺缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)[15]。此外，Khan等[16]發(fā)現(xiàn)咖啡因可顯著降低ROS和脂質(zhì)過氧化物水平，并增強Nrf2和HO-1的表達(dá)，從而改善鎘誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥和認(rèn)知障礙。研究還發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥度洛西汀對氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制也依賴于Akt/Nrf2/HO-1途徑[17]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)在SD大鼠創(chuàng)傷失血性休克發(fā)生后，大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁結(jié)構(gòu)的破壞和增厚，肺系數(shù)和肺濕/干重比增加，而經(jīng)外源性H2S干預(yù)后均可顯著改善。本研究中還發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷失血性休克可增加大鼠肺組織Nrf2和HO-1表達(dá)，說明Nrf2-HO-1信號通路可能參與了機(jī)體保護(hù)作用。干預(yù)后NaHS組Nrf2、HO-1表達(dá)進(jìn)一步增加，說明H2S可能通過Nrf2-HO-1信號分子通路來維持“氧供-氧耗”的平衡，增強機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力，從而減輕創(chuàng)傷失血性休克導(dǎo)致的肺損傷。

綜上所述，外源性H2S可能通過激活Nrf2-HO-1信號通路抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕炎性細(xì)胞浸潤和肺水腫，從而對創(chuàng)傷失血性休克大鼠產(chǎn)生肺保護(hù)作用。