Pannx1通道阻滯劑對急性癲癇小鼠海馬谷氨酸能神經元電生理變化的影響

倪紅 鄭卜真 王恩 柯紹發 馬傳花 王皖芬 羅莎

癲癇是一組以大腦神經元異常放電所引起的短暫性中樞神經系統功能失常為特征的慢性腦部疾病。臨床治療時，常用的傳統抗癲癇藥物作用有限，約40%的癲癇發作不能得到有效控制，且長期服藥會導致患者認知功能減退。尤其癲癇患者中兒童比例高，處于大腦發育期的患兒長期服藥對智力所造成的影響遠超成人患者。谷氨酸是哺乳動物腦內最重要的興奮性遞質，參與癲癇發生、學習、藥物依賴成癮、記憶及神經系統退行性疾病等多種病理生理過程。N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體，是中樞離子型谷氨酸受體。Pannx1是Pannx家族中唯一被證明可以形成功能通道的成員，在神經元和膠質細胞中均有表達[1-6]。Thompson等[7]研究發現NMDA受體激活后繼發的內向電流系Pannx 1通道開放所致，Pannx1通道可能在癲癇異常電活動中扮演重要角色，阻斷Pannx1通道能抑制癲癇發作。本實驗通過研究急性癲癇小鼠海馬谷氨酸能神經元的電生理變化及使用Pannx1通道阻滯劑干預后的電生理變化，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物選擇、建模及癲癇發作分級標準

1.1.1 實驗動物選擇 健康C57 Thy1-YFP小鼠45只，出生后 15～17 d，體重（15.0±0.5）g，雄性 24 只，雌性 21只，由蚌埠醫學院實驗動物中心提供。本實驗通過動物倫理委員會倫理審查，全程遵守實驗中心動物管理條例。將小鼠隨機分為癲癇組、Pannx1組和對照組，各15只。

1.1.2 建模 癲癇組、Pannx1組小鼠腹腔注射東莨菪堿注射液3 ml/kg，30 min后腹腔注射匹魯卡品注射液15 ml/kg，誘發V級癲癇發作持續1 h為建模成功，注射后未誘發Ⅲ級以上癲癇發作，可重復給予原劑量匹魯卡品，以5次為最高限。Pannx1組在建模前1 h腹腔注射甲氟喹溶液20 ml/kg[8]；癲癇組和對照組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液20 ml/kg。

1.1.3 癲癇發作分級 采用小鼠癇性發作分級標準（Racine標準）：0級：無面部陣攣，Ⅰ級：面部陣攣，Ⅱ級：Ⅰ級+節律點頭，Ⅲ級：Ⅱ級+前肢陣攣，Ⅳ級：Ⅲ級+后肢站立，V級：Ⅳ級+跌倒。

1.2 方法

1.2.1 腦片制備 小鼠癲癇發作持續10 min后腹腔注射2%的戊巴比妥注射液0.1 ml進行麻醉，斷頭取腦，在充分氧合的冰水混合人工腦脊液中切厚度400 μm的腦片，將其孵育在25℃充分氧和的人工腦脊液[9]中1～2 h，再轉移至31℃充分氧和的人工腦脊液灌流槽中進行電位記錄。

1.2.2 海馬谷氨酸能神經元的選擇 使用IR-DIC光學顯微鏡（日本Nikon公司，E600FN型）在腦片中選擇海馬谷氨酸能神經元，其在波長575 nm光激發下可發出黃色熒光。

1.2.3 海馬谷氨酸能神經元記錄和指標測定 使用Axoclamp-200B放大器膜片鉗電流鉗模式記錄海馬谷氨酸能神經元動作電位峰間距（inter-spike interval，ISI），電壓鉗模式記錄自發性興奮性突觸后電流（spontaneous excitatory postsynaptic current，sEPSC）。將電信號輸入到 pClamp-10（Axon Instrument Inc，Foster CA，USA）進行數據采集和分析。按照實驗要求設置去極化電流脈沖的強度和持續時間，誘發動作電位，放大器的高頻濾波為3 kHz。電壓鉗模式下將神經元膜電位鉗制在-65 mV記錄自發sEPSC。膜片鉗電極管內充滿標準電極液，滲透壓為 295～305 mOsmol，電極阻抗為 5～6 MΩ。ISI表示動作電位的發放能力，指去極化電流脈沖誘發動作電位中相鄰兩個動作電位峰頂點間的距離（圖1）。統計分析細胞膜靜息膜電位超過-70 mV的數據。sEPSC包括電流發放的間隔和幅度（圖2）。sEPSC的間隔和幅度結果以累積概率的50%表示，以進行統計比較[10]。

2 結果

2.1 3組小鼠海馬谷氨酸能神經元動作電位ISI比較 見圖 1、表 1。

由圖1、表1可見，Pannx1組小鼠海馬谷氨酸能神經元動作電位ISI較癲癇組延長，差異有統計學意義（P＜0.01）；癲癇組ISI較對照組明顯縮短，差異有統計學意義（P＜0.01）。

表1 3組海馬谷氨酸能神經元動作電位ISI的變化（ms）

圖1 3組小鼠海馬谷氨酸能神經元動作電位神經元動作電位峰間距（ISI）比較（a：癲癇組；b：Pannx1組；c：對照組）

2.2 3組小鼠海馬谷氨酸能神經元sEPSC比較 見圖2、表 2。

表2 3組海馬谷氨酸能神經元sEPSC間隔及幅度的變化

圖2 3組小鼠海馬谷氨酸能神經元自發性興奮性突觸后電流（sEPSC）比較

由圖2、表2可見，與對照組比較，Pannx1組、癲癇組海馬谷氨酸能神經元sEPSC間隔縮短，幅度增大，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；與癲癇組比較，Pannx1組sEPSC間隔增加、幅度減小，差異有統計學意義（P＜0.01）。

3 討論

癲癇的發病機制是近年來研究的熱點，目前研究認為癲癇的發生是由于興奮性神經元活性增強和谷氨酸釋放量增加，或抑制性神經元活性減弱和抑制性氨基酸遞質釋放量減少造成的。谷氨酸能神經元是腦內最主要的興奮性神經元，各類癲癇的發生幾乎均與其興奮性變化有關。谷氨酸能神經元形態呈錐形，有明顯的軸樹突，其典型特征是簇發放。sEPSC是由動作電位誘發的谷氨酸能神經元釋放谷氨酸而引起的自發興奮性突觸后電流。其中sEPSC的間隔表示單位時間內谷氨酸能神經元釋放谷氨酸的數量變化，包括谷氨酸能神經元遞質的釋放和由動作電位誘發的谷氨酸能神經元遞質釋放數目增減；sEPSC的幅度變化反映單位時間內突觸前遞質釋放量和突觸后膜受體數目或受體的反應性變化。sEPSC的間隔和幅度代表神經元接受外來信號并產生sEPSC的能力。ISI表示動作電位的輸出能力，是神經元興奮性的重要指標。本研究使用匹魯卡品建立癲癇動物模型，利用電壓鉗和電流鉗記錄海馬的谷氨酸能神經元sEPSC和ISI。通過研究發現在相同刺激強度、刺激時間下癲癇組較對照組ISI均明顯降低，sEPSC間隔縮短、幅度增大，表明癲癇發作后谷氨酸能神經元發放的動作電位個數增多，興奮性升高，發放沖動增加。

Pannx是10年前發現的一類膜蛋白通道，這些通道介導了細胞質和細胞外空間之間的分子交換[11]。Pannx1是Pannx家族中唯一被證明可以形成功能通道的成員。Pannx1通道可以在多種情況下被激活，包括機械應激、去極化、胞外K+升高、胞內Ca2+、嘌呤能受體激活或缺血[12-15]。Pannx1通道的開放被認為有害，主要見于炎癥、缺血性腦卒中或急性癲癇活動等病理狀態[16-18]。Dossi等[19]研究發現Pannx1通道激活通過嘌呤能2受體的三磷酸腺苷信號通路促進癲癇發作的產生和維持。Thompson等[7]在分離的海馬錐體神經元研究中發現NMDA受體激活后繼發的內向電流系Pannx 1通道開放所致，在海馬腦片中的研究中發現Pannx1干擾肽能顯著降低NMDA誘導的癲癇樣放電頻率和幅度以及阻斷并抑制錐體神經元攝取熒光染料，以上結果顯示Pannx1通道可能在癲癇異常電活動中扮演重要角色，阻斷Pannx1通道能抑制癲癇發作。

目前用于治療瘧疾的藥物甲氟喹對Pannx1通道有藥理抑制作用。Pinheiro等[12，20-21]在研究中發現甲氟喹可抑制海人酸模型小鼠癲癇自發發作的頻率和總時間，強烈抑制癲癇發作。本研究使用甲氟喹阻斷Pannx1通道，結果顯示Pannx1組較癲癇組海馬谷氨酸能神經元動作電位的ISI升高、sEPSC間隔增大、幅度降低，說明甲氟喹阻斷Pannx1通道能使癲癇小鼠海馬谷氨酸能神經元興奮性降低，有抑制神經元興奮性的作用，且甲氟喹有抗癲癇作用。甲氟喹通過血腦屏障有立體選擇性，在大腦的不同區域會達到不同的濃度。盡管甲氟喹是Pannx1的良好抑制劑[22]，但在少數瘧疾患者中已被證明可誘發癲癇發作[23-24]。甲氟喹由于作用于不同的靶點如神經元、星形細胞、鈉離子通道或內質網蛋白，而表現出多種不良反應[25]。這些報道顯示甲氟喹用于治療癲癇存在明顯的局限性。

綜上所述，甲氟喹阻斷Pannx1通道能抑制癲癇小鼠海馬谷氨酸能神經元的興奮性，但由于其不良反應，很難被認為是潛在的抗癲癇藥物，希望未來能不斷發現具有高選擇性的Pannx1通道阻斷劑，增加癲癇治療藥物的種類，從而控制難治性癲癇。