miRNA-4429靶向結合MCL1調控食管鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移與侵襲的機制研究

陸曉東 姚安軍 李靜云 陳凌子 唐志苗 金霞云

食管癌是最常見的癌癥之一，其死亡率居全球惡性腫瘤的第6位[1]。食管鱗狀細胞癌是食管癌的主要病理類型，占食管癌病例的90%以上[2]。盡管手術治療、放射治療及化學治療在食管鱗狀細胞癌治療方面取得較大進展，但食管鱗狀細胞癌發(fā)病率和病死率依舊較高。因此，深入研究食管鱗狀細胞癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制具有重要的臨床意義。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，長度為21～24個核苷酸，具有高度保守性，參與調控癌細胞生長、分化、遷移、侵襲和凋亡等生物學過程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[3]。近年來大量文獻表明，miRNA的異常表達參與食管鱗狀細胞癌進程，如miRNA-134[4]、miRNA-34a[5]、miRNA-216a-5p[6]和 miRNA-204-5p[7]等，而miRNA-4429在食管鱗狀細胞癌中的作用尚鮮見報道。基于此，本研究探討miRNA-4429靶向結合髓樣細胞白血病-1（MCL1）對食管鱗狀細胞癌細胞增殖、凋亡、遷移與侵襲的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 人食管鱗狀細胞癌細胞株（TE-13、KYSE140、EC9706、KYSE30）、293T 細胞株和人食管正常上皮細胞株Het-1A均購自上海中國科學院細胞庫；RPMI1640 培養(yǎng)基（批號：21870084）、FBS（批號：10091148）和 DMEM 培養(yǎng)基（批號：11995065）均購自美國Gibico公司；模擬物對照（mimics NC）和miRNA-4429模擬物（miRNA-4429 mimics）均購自上海吉瑪制藥公司；脂質體轉染試劑（批號：11668019）購自美國 Invitrogen公司；Trizol試劑（批號：R401-01）、凋亡檢測試劑盒（批號：A211-01）、逆轉錄試劑盒（批號：MR101-01）和qRT-PCR試劑盒（批號：MQ101-01）均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Transwell小室（批號：3422）和Matrigel基質膠（批號：354248）均購自美國Corning公司；CCK-8試劑盒（批號：C0037）購自上海碧云天生物技術研究所；TBST緩沖液（批號：T1085）購自北京索萊寶科技有限公司；MCL1抗體（批號：94296）購自美國Cell Signaling Technology公司。Multuskan Go 1510酶標儀購自美國Thermo公司；QTOWER 2.2熒光定量PCR儀購自德國analytikjena公司；奧林巴斯x71顯微鏡購自上海無陌光學儀器有限公司；化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)Tanon-5200Multi購自上海天能科技有限公司；CytoFLEX S型流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉染 將EC9706細胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取處對數(shù)生長期的EC9706細胞，以每孔5×105個接種于6孔板，待細胞融合度達到60%～70%時將培養(yǎng)液更換為無FBS培養(yǎng)液。按LipofectamineTM2000說明書，分別將miRNA-4429 mimics、mimics NC與脂質體試劑混合均勻并靜置20 min后，轉染至EC9706細胞，并分為實驗組和對照組，轉染4～6 h后，更換為正常的完全培養(yǎng)基。次日收集轉染后的細胞，檢測實驗組和對照組miRNA-4429相對表達量。

1.3 miRNA-4429相對表達量檢測 采用qRT-PCR法。收集細胞后加入1 ml Trizol，按照Trizol說明書進行總RNA的提取。所有樣本均取1 μg RNA逆轉錄為cDNA。qRT-PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性15 s，60℃退火30 s，70℃延伸30 s，共40個循環(huán)。引物序列如下：miRNA-4429上游引物為5'-CGCGAAAAGCTGGGCTGA-3'，下游引物為 5'-AGTGCAGGGTC－CGAGGTATT-3'；U6上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。以 U6 為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計算 miRNA-4429相對表達量。

1.4 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。收集轉染后的EC9706細胞，計數(shù)后每孔以2×103個細胞接種于96孔板，每組設置9個復孔，每隔24 h在固定時間點每孔加入10 μl CCK-8反應液于37℃孵育4 h，通過多功能酶標儀測定450 nm波長下的吸光度（OD）值，測定時間點分別為24、48、72和96 h，繪制增殖曲線。實驗重復3次，取平均值。

1.5 細胞克隆能力檢測 采用集落形成實驗。收集轉染后的EC9706細胞，計數(shù)后每孔以500個細胞接種于6孔板，每組設置3個復孔，每48 h更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)2周后棄去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定細胞，0.1%結晶紫染色，PBS洗滌并干燥后拍照，在顯微鏡下計數(shù)并分析集落形成數(shù)。實驗重復3次，取平均值。

1.6 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術。用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化轉染后的EC9706細胞，終止消化后收集 5×105個細胞，1 000 r/min、4 ℃離心 5 min，棄上清液。用預冷的PBS洗滌細胞兩次，1 000 r/min、4℃離心 5 min，棄上清液。加入 100 μl 1×Binding Buffer，輕輕吹勻至單細胞懸液。加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI Staining Solution，輕輕吹勻；避光、室溫 20～25 ℃孵育 10 min；加入 400 μl 1×Binding Buffer，輕輕混勻。染色后樣品在1 h內(nèi)用流式細胞儀進行檢測。每組實驗設計3個復孔，取平均值。

1.7 細胞遷移和侵襲數(shù)檢測 采用Transwell小室實驗。收集轉染后的EC9706細胞，經(jīng)過離心后采用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸計數(shù)后，稀釋成1×106個/ml的細胞懸液，取100 μl鋪板于Transwell上室，下室加入700 μl含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，采用4%多聚甲醛固定15 min后，用棉簽將上室未遷移的細胞擦拭干凈，結晶紫染色1 h，PBS洗滌后，顯微鏡下拍照并計算細胞遷移數(shù)。細胞侵襲實驗則需要提前將基質膠均勻鋪于Transwell上室并置于培養(yǎng)箱過夜成膜，后續(xù)操作按照細胞遷移實驗步驟，顯微鏡下拍照并計算細胞侵襲數(shù)。每組實驗設計3個復孔，取平均值。

1.8 miRNA-4429靶基因預測及熒光素酶報告基因實驗 采用miRWalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）、miRDB（http://mirdb.org/miRDB/）和 miRTarBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/search.php/）在線預測miRNA-4429靶基因。采用熒光素酶報告基因實驗驗證miRNA-4429是否靶向結合MCL1。將野生型或突變型（突變MCL1與miRNA-4429結合位點）的MCL1 3'非編碼區(qū)（3'UTR）片段分別插入到熒光素酶報告基因質粒（pMIR-REPORT Luciferase），內(nèi)參為 β-gal質粒（pMIR-REPORT β-gal control plasmid）。將 293T 細胞接種于24孔板中，細胞密度為1×106個/孔，培養(yǎng)24 h后進行轉染，轉染前每孔用PBS洗一遍，并將培養(yǎng)基更換為Opti-MEM培養(yǎng)基，每孔400 μl；將0.8 μg質粒（0.5 μg相應的熒光素酶報告基因質粒和 0.3 μg β-gal內(nèi)參質粒）加入50 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中，LipofectamineTM2000加入50 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中混勻，靜置5 min后兩者輕輕混勻，再靜置20 min之后加入24孔板中。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4～6 h后，將Opti-MEM換成含有2%FBS的培養(yǎng)基，每孔 400 μl，將15 pmol miRNA-4429模擬物或陰性對照加入50 μl Opti-MEM 培養(yǎng)基中，LipofectamineTM2000加入 50 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中混勻，靜置5 min后兩者輕輕混勻，再靜置20 min之后加入24孔板中。轉染48 h后，收集細胞裂解液，進行Luciferase和β-gal的測定，計算熒光素酶相對活性。每組實驗設計3個復孔，取平均值。

1.9 MCL1蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。收集轉染后實驗組和對照組EC9706細胞，用PBS洗滌兩遍后，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液用于總蛋白的提取，采用BCA試劑盒測定各組蛋白濃度。每組取40 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過濕轉法將目的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂牛奶封閉2 h。TBST溶液洗膜2～3次后，加入MCL1 抗體（1∶1 000）或 GAPDH 抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗膜2～3次后，加入過氧化物酶標記的抗兔或過氧化物酶標記的抗鼠的二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，TBST溶液洗膜2～3次后，加入顯影液顯影。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 miRNA-4429相對表達量比較 4株食管鱗狀細胞癌細胞中miRNA-4429相對表達量均明顯低于食管正常上皮細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見表1。而與對照組比較，實驗組細胞中miRNA-4429相對表達量顯著上調（P＜0.01），見表2。

表1 食管鱗狀細胞癌細胞與食管正常上皮細胞中miRNA-4429相對表達量比較

表2 實驗組和對照組細胞miRNA-4429相對表達量比較

2.2 兩組細胞增殖和克隆能力比較 實驗組細胞OD值在72、96 h均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見圖1a。與對照組比較，實驗組細胞集落形成數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1b、表3。

表3 兩組細胞集落形成數(shù)比較（個/視野）

圖1 兩組細胞增殖和克隆能力比較（a：兩組細胞增殖能力比較；b：兩組細胞克隆形成能力比較）

2.3 兩組細胞凋亡率比較 與對照組比較，實驗組細胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖2、表4。

表4 對照組和實驗中EC9706細胞凋亡率的比較

圖2 兩組細胞凋亡情況的比較

2.4 兩組細胞遷移和侵襲數(shù)比較 實驗組細胞遷移數(shù)及侵襲數(shù)均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見圖3（插頁）、表5。

表5 兩組細胞遷移、侵襲數(shù)比較（個/視野）

2.5 熒光素酶報告基因實驗結果及兩組MCL1蛋白表達水平比較 miR-4429與MCL1的3'UTR區(qū)結合位點見圖4a。共轉染MCL1 3'UTR-野生型熒光素酶報告載體后，與對照組比較，實驗組熒光素酶相對活性降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而共轉染MCL1 3'UTR-突變型熒光素酶報告載體后，實驗組與對照組熒光素酶相對活性比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖4b。實驗組MCL1蛋白表達水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖 4c。

3 討論

食管鱗狀細胞癌是人類最致命的惡性腫瘤之一，具有轉移快、治療難和復發(fā)率高等特點[8]。在中國，食管鱗狀細胞癌占據(jù)食管癌病例的90%以上[9]。研究食管鱗狀細胞癌發(fā)生、發(fā)展的相關潛在機制對于提高患者的總體生存率是非常必要的。據(jù)報道，miRNAs在細胞生長、凋亡和分化等生物學過程中均起著重要的調控作用。研究表明miRNA-4429在卵巢癌[10]、胃癌[11]、宮頸癌[12-14]、腦膠質瘤[15]、結直腸癌[16]、子宮內(nèi)膜癌[17]、甲狀腺乳頭狀癌[18]和腎透明細胞癌[19]中均呈低表達，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展，并起到抑癌的作用。目前關于miRNA-4429是否參與食管鱗狀細胞癌發(fā)生的研究尚鮮見報道。

本研究對食管鱗狀細胞癌細胞株（TE-13、KYSE140、EC9706、KYSE30）和食管正常上皮細胞株Het-1A中miRNA-4429相對表達量進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)miRNA-4429在食管鱗狀細胞癌細胞株中呈低表達，提示miRNA-4429可能在食管鱗狀細胞癌中發(fā)揮抑癌作用。為進一步探索miRNA-4429在食管鱗狀細胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，本研究對EC9706細胞進行轉染miRNA-4429 mimics。CCK-8、集落形成實驗和Transwell小室實驗結果顯示，實驗組較對照組EC9706細胞的體外增殖能力顯著抑制，克隆形成數(shù)目降低，遷移和侵襲能力降低。凋亡調控的失衡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要過程，本研究采用流式細胞術檢測EC9706細胞凋亡情況，結果發(fā)現(xiàn)miRNA-4429過表達可通過促進凋亡進而抑制EC9706細胞的增殖能力。一項關于腦膠質瘤的研究也發(fā)現(xiàn)miRNA-4429抑制劑可顯著抑制細胞凋亡，從而促進腦膠質瘤細胞的增殖[15]。以上結果均表明miRNA-4429的異常表達可能參與食管鱗狀細胞癌的進程。

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可直接互補結合下游靶基因的3'UTR，干擾靶基因的表達。本研究通過miRWalk、miRDB和miRTarBase預測miRNA-4429可能結合的靶基因，發(fā)現(xiàn)MCL1可能是miRNA-4429的作用靶基因。熒光素酶報告基因實驗的結果顯示，共轉染MCL1 3'UTR-野生型熒光素酶報告載體后，與對照組比較，實驗組熒光素酶相對活性降低；而共轉染MCL1 3'UTR-突變型熒光素酶報告載體后，實驗組與對照組熒光素酶相對活性比較差異無統(tǒng)計學意義，表明miRNA-4429可靶向結合MCL1。MCL1基因是細胞凋亡的關鍵調控因子，也是近年來促癌基因研究的熱點之一。MCL1在胃癌[20]、卵巢癌[21]、宮頸癌[22]以及食管鱗狀細胞癌[23]等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進程中起促進作用，扮演著促癌基因的角色。本研究結果表明上調miRNA-4429表達水平可顯著抑制MCL1的蛋白表達，說明miRNA-4429可靶向結合并負調節(jié)MCL1的表達，進而抑制食管鱗狀細胞癌的發(fā)展。

綜上所述，miRNA-4429在食管鱗狀細胞癌細胞中的表達下調，上調miRNA-4429的表達可抑制EC9706細胞的增殖、遷移和侵襲能力，提高EC9706細胞凋亡率，具體的作用機制可能為miRNA-4429靶向結合并降低MCL1的表達，從而干擾MCL1的促癌作用。本研究提示，miRNA-4429可能為食管鱗狀細胞癌發(fā)生和發(fā)展的潛在預測分子和治療靶點。