高膽紅素血癥新生兒腸道菌群特點及與β-葡萄糖醛酸苷酶活性的相關性

唐煒 盧紅艷 孫勤 許為民

（江蘇大學附屬醫院兒科，江蘇鎮江 212000）

［中國當代兒科雜志，2021，23（7）：677-683］

新生兒高膽紅素血癥是一種常見的疾病［1］。早期診斷和干預對防止可能引起的嚴重并發癥如膽紅素腦病等具有重要的臨床意義［2］。據估計，腸道菌群包含大約15 000～36 000個菌種［3］，參與了多種不同的腸道相關生理功能調控，這些細菌在維護腸壁的運動及其灌注和通透性、保持微生態屏障、調節免疫反應等方面有顯著的效果［4-5］。腸道微生態是一個代謝系統，可以作為潛在藥物治療靶點，在人體各種生理過程中起重要作用，是人體的有機組成部分［6］。既往研究表明［7］，人類胃腸道內超過400種細菌隨著環境及個體性差異表現出極大不同，共同作用調節人類胃腸道系統，進而調控多種生物體酶催化反應。早期新生兒階段的腸道富含氧氣，最先定植的是需氧菌和兼性厭氧菌，隨著時間的推移，嬰兒腸道內菌群種類由需氧菌和兼性厭氧菌向厭氧菌轉變。腸道菌群經歷了從無到有、從簡單到復雜、從不穩定到穩定的過程。高膽紅素血癥的發病機制中腸道內β-葡萄糖醛酸苷酶（β-glucuroni‐dase，β-GD）的活性是一個重要因素，β-GD參與膽紅素腸肝循環，在腸道內可將結合膽紅素水解脫下葡萄糖醛酸轉變成未結合膽紅素，由腸黏膜吸收，重新回到肝臟［8］。新生兒早期階段，由于胃腸道微生物群的延遲定居和非結合膽紅素在腸道內累計經歷了持續的腸肝循環和腸內循環，膽紅素誘導的微生物群在早期新生兒階段是缺少的，腸道微生物對于新生兒膽紅素的代謝具有非常大的影響［9］。有學者提出，應該針對這個“窗口期”干預嬰兒的腸道微生態以使其更好地適應未來環境［10］。16SrRNA基因很早就應用在微生物菌種鑒定的工作當中，目前已經有效地應用于腸道微生物領域［11］。目前尚未有探討高膽紅素血癥新生兒膽紅素水平、腸道菌群和β-GD活性相關性的研究。

本研究通過16SrRNA高通量測序方法系統分析高膽紅素血癥新生兒腸道菌群分布特點，采用酚酞-葡萄糖醛酸底物法，用紫外分光光度計測定置換出的酚酞濃度來代表β-GD活性，比較高膽紅素血癥新生兒治療前后腸道內β-GD活性，探討腸道菌群差異分布對β-GD活性的影響及其與高未結合膽紅素血癥發生的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2018年1～12月入住江蘇大學附屬醫院新生兒科的高膽紅素血癥新生兒作為研究對象進行前瞻性研究。本研究已通過江蘇大學附屬醫院倫理審查（審查號：SWYXLL20200429-4），并簽署家屬知情同意書。

參考《新生兒高膽紅素血癥診斷和治療專家共識》中光療指征確定納入標準［12］：（1）新生兒母親為初產婦，年齡20～35歲，無妊娠高血壓綜合征、腎病、貧血及糖尿病等妊娠合并癥；（2）胎兒經陰道分娩，出生時無產傷窒息，Apgar評分正常，出生體重2 500～4 000 g，胎齡37～42周，生后半小時開奶，純母乳喂養；（3）生后3～5 d皮膚出現黃染，血清總膽紅素超過Bhutani曲線第95百分位數，以非結合膽紅素增高為主。出生時或生后伴有呼吸窘迫、頭顱血腫、顱內出血、溶血、咽下綜合征、感染性疾病等新生兒疾病者予以排除。最終有50例新生兒納入高膽紅素血癥組。選擇同期我院產科母嬰同室新生兒作為對照組。納入標準：胎齡37～42周，日齡5～7 d，血清總膽紅素不超過Bhutani曲線第95百分位數。排除標準：出生時或生后伴有呼吸窘迫、頭顱血腫、顱內出血、溶血、咽下綜合征及感染性疾病等新生兒疾病。對照組最終納入了30例新生兒。

1.2 標本采集、保存和處理

高膽紅素血癥組新生兒入院后給予光療，采集其入組第1天（治療前）及入組第3天（治療后）糞便標本，-80oC保存備用，用于腸道菌群分析和β-GD活性測定；同時在各時間點抽取靜脈血3 mL用于測定肝功能和β-GD活性。采集對照組入組第1天及入組第3天的糞便標本，-80oC保存備用，用于腸道菌群分析；同時抽取靜脈血3 mL用于測定肝功能。

1.3 腸道菌群檢測

（1）16SrRNA高通量測序：提取所有納入研究新生兒糞便標本基因組DNA（genomic DNA，gDNA），通過Onedrop儀器和2%瓊脂糖凝膠電泳對DNA濃度和純度進行檢測；合格后進行PCR擴增，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的濃度和質量，MD酶標儀檢測產物濃度，QIAquick PCR Purification Kit回收產物，Aglient 2200 Bioanalyzer進行質控；合格后予Illumina MiSeq高通量測序儀測序。

（2）生物信息學分析：首先對原始數據進行拼濾，得到有效數據。然后基于有效數據進行Operational Taxonomic Units（OTUs）聚類和物種分類分析，并將OTUs和物種注釋結合，從而得到每個樣品的OTUs和分類譜系的基本分析結果。再對OTUs進行豐度分析。菌群屬水平相對豐度=該菌的基因拷貝數/總拷貝數。

1.4 β-GD活性的測定

酶活性單位為在實驗規定條件下，每分鐘催化1μmol底物所需的酶量。β-GD活性通常用每分鐘稀釋出的酚酞量來表示，即U/L。取標本瓶中標本0.1 mL加磷酸鹽緩沖液0.8 mL，分別置于正常對照管、高膽紅素血癥治療前管和高膽紅素血癥治療后管中。高膽紅素血癥治療前管和高膽紅素血癥治療后管中加基質液0.1 mL；混勻后置37℃水浴18 h，取出后用流水冷卻5 min，在正常對照管加入基質液0.1 mL；三管中分別加入甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液3 mL及75%乙醇1 mL；以正常對照管進行調零，波長為550 nm，用723分光光度計讀取測定管光密度，查標準曲線即得0.1 mL標本中β-GD濃度，再將此值換算成每升標本中該酶的濃度。

1.5 統計學分析

采用SPSS16.0統計軟件對數據進行統計學分析。非正態分布的計量資料以中位數（四分位數間距）［M（P25，P75）］表示，兩獨立樣本組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，治療前后樣本的比較采用Wilcoxon符號秩檢驗。組間所有樣本菌群差異比較采用主成分分析（principal component anal‐ysis，PCA）。正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩獨立樣本的比較采用成組t檢驗，治療前后的比較采用配對t檢驗。計數資料用例數或百分率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗。應用Spearman相關分析法評估糞便β-GD活性與相關菌群之間的關系。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料的比較

高膽紅素血癥組50例新生兒中，男22例，女28例；胎齡（39.2±2.6）周，日齡（4.3±0.2）d，出生體重（3.3±0.5）kg。對照組30例新生兒中，男16例，女14例；胎齡（39.1±2.0）周，日齡（4.2±0.7）d，出生體重（3.2±0.3）kg。兩組性別（χ2=0.028，P=0.87）、胎齡（t=0.76，P=0.45）、日齡（t=1.09，P=0.28）和出生體重（t=1.47，P=0.16）的比較差異均無統計學意義。

2.2 新生兒腸道菌群PCA分析

基于所有菌屬，對高膽紅素血癥組和對照組腸道菌群進行PCA分析，顯示入組第1天高膽紅素血癥組和對照組腸道菌群構成存在差異（P＜0.05）；入組第3天高膽紅素血癥組和對照組腸道菌群構成也存在差異（P＜0.05）；高膽紅素血癥組入組第1天和入組第3天（治療前后）腸道菌群構成的差異也有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 高膽紅素血癥組和對照組腸道菌群的PCA分析 圖中每個點代表一個樣本，點間距離越小，腸道菌群越相似，點間距離越大，腸道菌群構成差異越明顯。PC1表示第一主成分，33.1%表示第一主成分對樣品差異的貢獻值；PC2表示第二主成分，11.5%表示第二主成分對樣品差異的貢獻值。

2.3 入組第1天高膽紅素血癥組和對照組腸道菌群分析

選取入組第1天高膽紅素血癥組腸道菌群屬水平相對豐度前96%的菌屬，與對照組進行腸道菌屬之間的比較，結果顯示，兩組間共檢出52種差異具有統計學意義的細菌，其中腸球菌屬、埃希氏菌屬、未分類的腸桿菌屬等細菌在高膽紅素血癥組腸道內的豐度明顯高于對照組（P＜0.05）；擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬、未分類的毛螺旋菌屬等細菌在對照組腸道內的豐度明顯高于高膽紅素血癥組（P＜0.05）。兩組差異較明顯的前20位細菌的腸道菌群屬水平的比較見表1和圖2。

圖2 入組第1天高膽紅素血癥組和對照組腸道菌群分析

表1 入組第1天高膽紅素血癥組和對照組腸道菌群屬水平相對豐度的比較［M（P25，P75）］

2.4 入組第3天高膽紅素血癥組和對照組腸道菌群分析

選取入組后第3天高膽紅素血癥組屬水平豐度前96%的菌屬，與對照組進行腸道菌屬的比較，結果顯示，兩組間共檢出42種差異具有統計學意義的細菌，其中腸球菌屬、未分類的腸桿菌屬、鏈球菌屬等細菌在高膽紅素血癥組腸道內的豐度明顯高于對照組（P＜0.05），而擬桿菌屬、未分類的毛螺旋菌屬、Faecalibacterium等細菌在高膽紅素血癥組的含量明顯低于對照組（P＜0.05）。兩組差異較明顯的前20位細菌的腸道菌群屬水平的比較見表2和圖3。

圖3 入組第3天高膽紅素血癥組和對照組腸道菌群分析

表2 入組第3天高膽紅素血癥組和對照組腸道菌群屬水平相對豐度的比較 ［M（P25，P75）］

2.5 高膽紅素血癥新生兒治療前后腸道菌群分析

高膽紅素血癥新生兒治療前（入組第1天）和治療后（入組第3天）腸道菌群分析顯示，共檢出2種差異具有統計學意義的細菌，即埃希氏菌屬和葡萄球菌屬在高膽紅素血癥組治療后腸道內含量明顯低于治療前（P＜0.05），見表3。

表3 高膽紅素血癥新生兒治療前后腸道菌群屬水平相對豐度的比較 ［M（P25，P75）］

2.6 高膽紅素血癥新生兒治療前后糞便和血液中β-GD活性的變化

高膽紅素血癥組新生兒治療后糞便中β-GD活性較治療前明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），而治療前后血清β-GD活性差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 高膽紅素血癥新生兒治療前后β-GD活性的變化（±s，U/L）

表4 高膽紅素血癥新生兒治療前后β-GD活性的變化（±s，U/L）

項目糞便β-GD血清β-GD治療前(n=50)1.19±0.26 0.29±0.12治療后（n=50)0.63±0.21 0.22±0.09 t值9.032 0.501 P值0.001 0.620

2.7 高膽紅素血癥新生兒治療前后糞便β-GD活性與差異菌群之間的相關性

高膽紅素血癥新生兒治療前糞便β-GD活性與葡萄球菌屬和埃希氏菌屬豐度呈顯著正相關（分別rs=0.6385、0.5948，均P＜0.01）；治療后糞便β-GD活性與葡萄球菌屬和埃希氏菌屬豐度亦呈顯著正相關（分別rs=0.7245、0.6087，P＜0.01）。

3 討論

本研究發現高膽紅素血癥組和對照組腸道菌群構成存在明顯差異，其中腸球菌屬、埃希氏菌屬、未分類的腸桿菌屬等細菌在高膽紅素血癥組腸道內含量明顯高于對照組；擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬、未分類的毛螺旋菌屬等細菌在對照組腸道內含量明顯高于高膽紅素血癥組。高膽紅素血癥組治療后腸球菌屬、未分類的腸桿菌屬、鏈球菌屬等細菌的含量明顯高于對照組；擬桿菌屬、未分類的毛螺旋菌屬、Faecalibacterium等細菌則明顯低于對照組；高膽紅素血癥組治療后腸道內埃希氏菌屬、葡萄球菌屬含量明顯低于治療前。Ⅴítek等［13］發現大鼠口服抗生素后血清膽紅素水平顯著升高。此外，Tuzun等［14］和Thongaram等［15］指出，雙歧桿菌屬成員，如兩歧雙歧桿菌和長齒桿菌的下調與血清膽紅素水平升高有關，這些研究結果提供了腸道微生物群可能參與膽紅素代謝的證據。

近年來，新生兒高膽紅素血癥的發病率呈逐年上升趨勢，高膽紅素血癥占新生兒住院病因的首位［16］。若診斷和治療不及時，過高的血清膽紅素可以引起患兒全身多器官功能損害，膽紅素還可通過血腦屏障干擾神經細胞的正常代謝［17］，造成神經系統功能的紊亂，出現致殘甚至致死的情況［18］。腸道菌群在膽紅素的代謝過程中起到了至關重要的作用。此外，腸道菌群又能參與機體代謝，完成數種宿主細胞不能催化進行的酶反應，腸道菌群及其代謝產物影響宿主的代謝穩態［19］，機體代謝功能的障礙與腸道菌群的變化密切相關。另外，腸道菌群還可通過改變肝功能調節膽紅素的代謝，完善免疫系統，提高肝酶活性，促進膽紅素的結合和排泄。腸道的微生物及其代謝產物對于維持血清膽紅素水平有很大的作用［20-21］，腸道微生物對于新生兒膽紅素代謝有影響，加強腸道代謝則可能降低血清膽紅素水平［22］。

本研究還發現高膽紅素血癥組新生兒治療前后糞便β-GD活性與葡萄球菌屬和埃希氏菌屬豐度均呈正相關。有研究表明，梭狀芽孢桿菌、葡萄球菌、大腸埃希菌、腸球菌等可產生β-GD，經體內外培養后測定均表現為陽性，而雙歧桿菌、乳酸桿菌等在體內外均不產生β-GD［23-24］。膽紅素進入腸道后，其進行腸肝循環還是排出體外，腸道菌群起著非常重要的作用。微生物組編碼的β-GD在人類胃腸道中扮演了重要的角色。由于新生兒胃腸道微生物定植不充分和延遲，參與膽紅素代謝的微生物群相對較少，積累在腸道腔內的未結合膽紅素可經歷大量的肝腸循環和腸道循環，使得新生兒血清膽紅素水平升高。當新生兒腸道菌群中與β-GD增高相關的菌種增加，β-GD在腸道內含量增高，它可能導致新生兒非結合膽紅素水平增高。新生兒腸道菌群在門水平上由厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、疣微菌門等構成。腸道菌群在體內產生的β-GD根據有無完整的細菌環分為兩種類型：L-β-GD（有完整的細菌環）和NL-β-GD（無完整的細菌環）。厚壁菌門、變形菌門產生的β-GD屬于L-β-GD，而擬桿菌門產生的β-GD屬于NL-β-GD。葡萄球菌屬在門水平上屬于厚壁菌門，埃希氏菌屬在門水平上屬于變形菌門，這兩種高未結合膽紅素血癥新生兒腸道內的優勢菌在體內產生L-β-GD。L-β-GD具有完整的細菌環，能夠發揮酶的作用，分解膽紅素-葡萄糖醛酸酯之間連接的酯鏈，使腸道內的結合膽紅素轉化為未結合膽紅素，而未結合膽紅素是一種脂溶性的非極性物質，易于在小腸部位重新吸收進入腸肝循環，使得血清中膽紅素水平增高［25］。β-GD的數量和結構的差異影響了腸肝循環和血清膽紅素水平。

綜上，本研究顯示了高膽紅素血癥新生兒和非高膽紅素血癥新生兒腸道菌群存在差異，糞便中與膽紅素腸肝循環關系密切的β-GD活性與差異菌葡萄球菌屬和埃希氏菌屬豐度呈正相關性。腸道菌群可能通過調節β-GD活性影響新生兒高膽紅素血癥的發生，通過對新生兒腸道菌群、β-GD活性進行測定和分析，對早期評估新生兒高膽紅素血癥的發生有一定的臨床意義。這些研究結果是目前證明人體腸道菌群可以影響血清膽紅素水平的有力證據。后期將通過宏基因組測序和代謝組學等方法進一步分析腸道微生態對新生兒血清膽紅素水平影響的具體作用機制。