難治性肺炎支原體肺炎患兒支氣管肺泡灌洗液中肺炎支原體耐藥基因檢測分析

陳丹 張娜麗 張婷 孫曉敏

（鄭州大學附屬兒童醫院/河南省兒童醫院/鄭州兒童醫院 1.普內科；2.呼吸科，河南鄭州 450000）

［中國當代兒科雜志，2021，23（7）：707-712］

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是一種介于細菌和病毒之間的病原微生物，也是兒童社區獲得性肺炎最常見的病原體之一，可引起各種臨床癥狀，甚至危及患兒生命安全［1］。兒童肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniaepneumonia，MPP）大約占社區獲得性肺炎的10%～30%，近年來，MPP發病率呈現逐漸上升趨勢［2-3］。目前，大環內酯類藥物是治療兒童MPP的首選治療藥物，一直以來均取得了良好效果，但隨著大環內酯類藥物在臨床上的廣泛應用，其耐藥現象越來越嚴重，且難治性肺炎支原體肺炎（refractoryMycoplasmapneumoniaepneumonia，RMPP）病例越來越多［4］。MP對大環內酯類藥物耐藥的分子機制為紅霉素的作用靶位23SrRNAⅤ區中心環2063及2064位點突變［5］。基于MP僅有1個rRNA操縱子，通常認為23SrRNAⅤ區中心環2063及2064位點突變與大環內酯類藥物耐藥有關［6］。但有關RMPP患兒支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中MP耐藥基因情況的報道缺乏大樣本量研究。本研究擬分析245例RMPP患兒BALF中MP耐藥性及耐藥基因分布情況，以期為臨床用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2016年3月至2020年12月鄭州大學附屬兒童醫院收治的RMPP患兒245例為研究對象，其中男133例，女112例，年齡4～13歲，平均年齡（5.2±1.2）歲。納入標準：（1）符合《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識（2015年版）》［7］中有關MPP診斷標準：①有急性發熱、咳嗽等呼吸道感染癥狀；②胸部影像學檢查顯示肺部病灶；③血清MP抗體滴度≥1∶160，或血清MPIgM陰性但1周內轉陽，或MPDNA檢測結果陽性。（2）符合RMPP診斷標準，即使用大環內酯類抗生素進行規范治療7 d以上，其臨床癥狀及胸部影像學仍然持續加重。排除標準：（1）合并呼吸道合胞病毒、腺病毒及流感病毒等7種常見呼吸道病毒混合感染患兒；（2）排除重癥MPP患兒；（3）存在肺部基礎疾病患兒；（4）肺結核或既往支氣管哮喘患兒。標本采集取得患兒監護人同意，同時本研究經醫院醫學倫理委員會審批及通過（2021-K-037）。

1.2 BALF采集

嚴格按照《兒科支氣管鏡術指南（2009年版）》［8］標準和操作規范執行。術前禁食禁水，患兒進入支氣管鏡檢查室，選擇平臥位，使用呋麻滴鼻液滴鼻，并使用咪達唑侖針劑鎮靜，再取合適量的丁卡因膠漿涂抹支氣管鏡管。使用電子支氣管鏡（型號：BF-IT290，日本Olympus公司）經患兒一側鼻孔進鏡，注入利多卡因麻醉，同時逐步進鏡，直至到達病變部位，使用0.9%氯化鈉溶液進行支氣管肺泡灌洗（患兒體重≤20 kg時，每次灌洗量為1 mL/kg；患兒體重＞20 kg時，每次灌洗量為2 mL/kg），灌洗3次，灌洗液總量≤10 mL/kg，立即將無菌痰液收集器連接至支氣管鏡操作孔道，并以100～150 mm Hg負壓抽吸以獲取BALF標本。肺泡灌洗后回收率＞40%、無大氣道分泌物混入及紅細胞＜20%為合格標本。將留取的BALF標本分裝成2份，1份送病原學檢測，1份送耐藥基因檢測。

1.3 MP DNA檢測

采用Real-Time PCR法檢測MPDNA，試劑盒購買自中山大學達安基因股份有限公司，以MP DNA＞1.0×104copies/mL為陽性。選取陽性標本用作下一步耐藥基因檢測。

1.4 MP耐藥基因檢測

（1）提取BALF標本和MP標準株中MPDNA。（2）檢測23SrRNA基因位點突變，PCR擴增程序為：94℃預 變 性5 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，35個循環；72℃延伸5 min；取PCR擴增產物10μL與6×上樣緩沖液1μL混合，采用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，并拍照和記錄結果；引物序列為：F：5'-ACTATAACGGTCCTAAGGTA-3'，R：5'-ACCTATTCTCTACATGATAA-3'，片 段 大 小為244 bp，引物由上海英駿生物技術有限公司設計和生產。（3）DNA測序：將23SrRNA基因PCR擴增產物標本及MP標準株PCR擴增產物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將所得測序結果與MP標準株23SrRNA基因序列進行比對，從而確定23SrRNA基因位點基因型。

1.5 統計學方法

應用SPSS 19.0統計學軟件分析數據，計數資料以構成比或率（%）表示，組間比較進行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RMPP患兒支氣管鏡下表現及MP DNA檢測結果

245例行支氣管鏡檢查的RMPP患兒中，鏡下全表現為充血水腫（100%），縱行皺襞82例（33.5%），結節突起54例（22.0%），黏膜糜爛、壞死44例（18.0%），痰栓及支氣管樹樣管型或黏稠物40例（16.3%），支氣管炎性狹窄25例（10.2%），管腔變形8例（3.3%），支氣管閉塞3例（1.2%）。245份BALF標本中，MPDNA檢測陽性207例，陽性率為84.5%（207/245）。

2.2 RMPP患兒對不同抗菌藥物的耐藥性

藥敏試驗結果顯示，RMPP患兒對大環內酯類抗菌藥物耐藥率均較高（＞70%），耐藥率由高到低依次為克拉霉素、羅紅霉素、克林霉素、乙酰螺旋霉素、紅霉素及阿奇霉素；對喹諾酮類抗菌藥物耐藥率均較低（＜5%）。見表1。

表1 207例MP DNA檢測陽性RMPP患兒對不同抗菌藥物的耐藥性分析 ［例（%）］

2.3 PCR擴增結果

PCR擴增產物電泳后經凝膠成像系統分析結果顯示，陽性BALF標本和MP標準株在244 bp處出現條帶，陰性對照未出現特異性條帶，23SrRNAⅤ區PCR擴增產物基因片段大小為244 bp，如圖1。

圖1 23SrRNA V區PCR擴增產物電泳圖 M為marker，1為陰性對照，2～12為陽性BALF標本，13為MP標準株。

2.4 基因測序結果

207例MPDNA檢測陽性RMPP患兒BALF標本基因測序結果顯示，41例（19.8%）無耐藥基因突變，166例（80.2%）存在耐藥基因突變，其中154例（74.4%）突變位點為23SrRNAⅤ區中心環2063位A→G點突變，7例（3.4%）突變位點為2064位A→G點突變，5例（2.4%）為2063和2064雙位點突變。166例MP 23SrRNA基因點突變中2063位點突變率達95.8%（159/166）。見圖2～3。

圖2 MP標準株基因測序圖 無點突變。

圖3 23SrRNAⅤ區中心環2063位A→G點突變基因測序圖 箭頭所示為突變位點。

2.5 23SrRNAⅤ區中心環2063位等位基因與抗菌藥物耐藥性的關系

23SrRNAⅤ區中心環2063位A→G點突變對大環內酯類抗菌藥物耐藥性影響較大，克拉霉素、羅紅霉素、克林霉素、乙酰螺旋霉素、紅霉素及阿奇霉素耐藥病例的2063位等位基因分布比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；左氧氟沙星、司帕沙星、加替沙星的耐藥病例2063位等位基因分布比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 23SrRNAⅤ區中心環2063位等位基因與抗菌藥物耐藥性的關系 ［例（%）］

3 討論

大環內酯類藥物因其不良反應小、使用方便已成為治療兒童MPP的一線治療藥物［9］。但自2000年以來，世界范圍內抗大環內酯類MP逐漸流行［10］。有研究發現，大環內酯類藥物耐藥現象日趨嚴重，在我國尤為突出［11］。姜越等［12］報道指出，2011年北京地區兒童MP感染率較高，且對大環內酯類抗菌藥物耐藥現象嚴重。Ma等［13］通過分析深圳市兒童大環內酯類耐藥MP發現，大環內酯類藥物對大環內酯類耐藥MP患兒的療效差于大環內酯類敏感MP患兒。本研究藥敏試驗結果顯示，RMPP患兒對大環內酯類抗菌藥物耐藥率均較高（＞70%），耐藥率由高到低依次為克拉霉素、羅紅霉素、克林霉素、乙酰螺旋霉素、紅霉素及阿奇霉素，對喹諾酮類抗菌藥物耐藥率均較低（＜5%）。提示MP對大環內酯類藥物均具有較高的耐藥率，而對喹諾酮類抗菌藥物較敏感，但也出現少數耐藥，可能與喹諾酮類抗菌藥物在MPP患兒中使用增加有關。喹諾酮類抗菌藥物耐藥機制為，藥物與MP作用靶點為DNA促旋酶及拓撲異構酶Ⅳ，而編碼這兩種酶的任一基因發生突變均可能會導致耐藥。另外，兒童處于生長發育的階段，喹諾酮類藥物可對其軟骨和關節造成損傷，提示臨床上針對MPP患兒需要謹慎使用喹諾酮類抗菌藥物。

MP對大環內酯類藥物耐藥機制的研究重點為基因突變。大環內酯類藥物通過與核糖體50S亞基23SrRNA結構域V區結合，從而抑制蛋白質合成［14］。有研究表明，MP對大環內酯類藥物耐藥機制為核糖體50S亞基23SrRNA結構域Ⅴ區及Ⅱ區核苷酸序列變化，從而降低其與核糖體的親和力，最終導致耐藥［4］。另有研究證實，核糖體蛋白中23SrRNA結構域Ⅱ、Ⅴ、L4和L22的突變與其他物種的大環內酯類藥物抗性有關［15］。本研究結果顯示，207例MP DNA檢測陽性標本中，41例（19.8%）無耐藥基因突變，166例（80.2%）存在耐藥基因突變，其中154例（74.4%）突變位點為23SrRNAⅤ區中心環2063位A→G點突變，7例（3.4%）突變位點為2064位A→G點突變，5例（2.4%）為2063和2064雙位點突變，提示23SrRNA V區中心環2063、2064位點突變是MP對大環內酯類抗菌藥物耐藥的分子基礎。本研究尚未發現L4和L22突變，與姚慧生等［16］報道相符。具體而言，大環內酯類耐藥MP在23SrRNA結構域Ⅴ區存在1個點突變，該突變主要發生在序列的2063和2064位點，且以2063位A→G點突變最為常見，2063位A→G點突變主要引起14和15元環高度耐藥，而2064位A→G點突變主要引起16元環高度耐藥。另外，大環內酯類藥物的主動外排系統和藥物滅活作用也可能是導致出現MP耐藥的重要原因。本研究結果還顯示，166例MP 23SrRNA基因點突變中高達159例存在2063位點突變，突變率為95.8%。鄭玥等［17］報道發現，＞60%的大環內酯類抗菌藥物耐藥患兒可檢測到2063位A→G點突變，檢測RMPP患兒耐藥基因對其早期診斷具有重要意義。Yuan等［18］通過分析120例住院MPP患兒臨床特點和耐藥性，結果發現，近90%的耐藥菌株在23SrRNA基因2063位出現A→G突變。此外，23SrRNAⅤ區中心環2063位A→G點突變對大環內酯類抗菌藥物耐藥影響較大，克拉霉素、羅紅霉素、克林霉素、乙酰螺旋霉素、紅霉素及阿奇霉素耐藥病例的2063位等位基因分布比較，差異均具有統計學意義，提示大環內酯類抗菌藥物耐藥與23SrRNA位A→G點突變密切相關。而左氧氟沙星、司帕沙星、加替沙星耐藥病例的2063位等位基因分布比較，差異均無統計學意義，提示喹諾酮類抗菌藥物耐藥可能與23SrRNA位點突變并無相關性。故RMPP患兒BALF中MP對大環內酯類抗菌藥物耐藥率較高，對喹諾酮類抗菌藥物敏感，提示臨床需重視RMPP患兒的耐藥監測，合理選擇抗菌藥物，以減少耐藥菌株的產生。但本研究仍存在不足，僅涉及常見的2063和2064位點，而對于耐藥菌株是否存在其他位點突變及其耐藥機制有待深入探討。此外，本研究缺乏以普通MP肺炎患兒作為對照，無法深入反映耐藥基因在RMPP發病中的作用，后續有待進一步研究。

綜上所述，RMPP患兒BALF中MP對大環內酯類抗菌藥物耐藥率較高，23SrRNA V區中心環2063位點突變可能影響MP的耐藥機制，臨床需及時監測RMPP患兒的耐藥情況，并合理選擇抗菌藥物，以減少耐藥菌株的產生，從而為MP治療提供科學根據。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。