環狀RNA在炎癥所致早產小鼠腦損傷中的作用及機制初步研究

魏思萌 肖謐 鄭曦 劉俐

（西安交通大學第一附屬醫院新生兒科，陜西西安 710061）

［中國當代兒科雜志，2021，23（7）：730-734］

母親孕期炎癥反應（如絨毛膜羊膜炎）是目前公認嬰兒早產的重要原因。病原體感染后，可經陰道上行到胎膜，或經母血到胎盤使早產發生，甚至引起胎兒炎癥反應的激活。同時，胎兒炎癥反應的激活可影響其正常的腦神經發育，造成早產兒髓鞘形成、軸突完整性及突觸發生等事件受抑制，影響腦白質和深部灰質的發育，從而引起腦結構和功能的改變、行為及認知障礙等嚴重神經系統后遺癥［1-2］。近年來，隨著早產兒腦損傷發生機制的不斷研究，多種蛋白編碼基因如Cdk2基因、Wnt/βcatenin、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、炎性細胞因子等被證明參與炎癥所致早產腦損傷的發生及發展［3-5］，但仍未闡明其調節關鍵點，轉化為臨床新防治手段有一定難度。

本課題組已成功建立炎癥誘導早產小鼠腦損傷模型，并在證實lncRNA在早產兒腦白質損傷發病機制中起重要作用的基礎上［5-6］，發現一類環狀RNA（circular RNA，circRNA）。circRNA是一類具有穩定閉合環狀結構的內源性RNA分子，序列高度保守，在哺乳動物中大量并穩定存在。相比于lncRNA、微 小RNA（microRNA，miRNA）等，circRNA功能及作用機制更豐富［7-9］，更易實現對編碼基因的多層次體外調控并獲得臨床應用價值。已有研究表明，circRNA與神經系統發育、分化和生物學功能有密切關系［10-12］，但目前circRNA與早產腦損傷的相關性研究甚少。本研究通過微陣列基因芯片技術篩選與炎癥誘導早產腦損傷相關的差異表達circRNA，初步探討circRNA在炎癥所致早產腦損傷中的作用，尋找早產腦損傷早期診治的新突破口。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

本研究所用的雌性BALB/c小鼠與雄性C57BL/6小鼠由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，研究內容已經西安交通大學醫學部生物醫學倫理委員會批準（2020-229）。所有方法均按照相關指南和規定執行。脂多糖購于美國Sigma公司；GeneChip Mouse Transcriptome（MT）Array 1.0芯片購自美國Affymetrix公司；芯片數據分析由上海康成公司提供；TRIzol購自美國Invitrogen公司。

1.2 炎癥誘導早產小鼠腦損傷模型制備

4只C57BL/6雄性小鼠和10只BALB/c雌性小鼠在SPF級環境中飼養至7周齡。適應性喂養1周后，雌雄小鼠按2∶1配種，每日觀察2次。檢測到陰道栓當日定為妊娠第0天。將孕鼠隨機分為炎癥早產組（n=3）：妊娠17 d時孕鼠腹腔注射適量脂多糖（125μg/kg），在第18天產活仔；非炎癥早產組（n=3）：孕鼠腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，孕18 d時給予2%異氟醚進行呼吸麻醉，剖宮產法取胎鼠［5-6］。取兩組早產小鼠腦組織置于液氮中快速冷卻保存。

1.3 樣本總RNA的提取與檢測

使用TRIzol試劑從胎鼠腦組織中提取總RNA，并使用RNeasy mini試劑盒（Qiagen，Hilden，德國）按照說明書進行純化。使用1%變性凝膠電泳檢測RNA完整性。采用納米滴分光光度計ND-2000測定RNA濃度和純度，樣品光密度（OD）260/OD280為1.8～2.1，OD260/OD230＞1.8為合格樣品。

1.4 芯片雜交

兩組各取3只仔鼠腦組織，共6個樣本。分別對6個樣本中提取的總RNA進行circRNA表達分析，用Rnase R（Epicentre Technologies，Madison，美國）消化總RNA，去除線性RNA，豐富circRNA。之后通過隨機引物法（Arraystar Super RNA Labeling Kit，美國）擴增并轉錄成熒光cRNA。將標記的RNA雜交到Arraystar Human circRNA陣列（Rockville，美國）。洗完載玻片后，用安捷倫掃描儀G2505C對陣列進行掃描。采用Agilent Feature Extraction軟件（version 11.0.1.1）對獲取的陣列圖像進行分析。以上芯片測序部分在上海康成公司進行。

1.5 統計學分析

采用SPSS19.0統計軟件對數據進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。運用miRanda軟件分析預測circRNA可能結合的miRNA。

2 結果

2.1 腦組織樣本總RNA質檢結果

所有腦組織樣本總RNA的OD260/OD280值均在1.8～2.2之間，瓊脂糖凝膠電泳可見28S和18S兩條核糖體RNA條帶（圖1），質量檢測結果全部通過（表1），可用于后續芯片檢測。

表1 小鼠腦組織RNA質檢結果

圖1 腦組織樣本總RNA電泳圖 注：1～3分別為炎癥組小鼠腦組織3個樣本；4～6分別為非炎癥組小鼠腦組織3個樣本。

2.2 circ RNA差異表達譜可視分析

將質檢合格的6份樣本進行芯片檢測，將所得芯片結果進行預處理、歸一化后選擇相對表達量比值在1.5倍以上，且差異有統計學意義的circRNA作為差異表達的circRNA（P＜0.05）。根據芯片檢測結果繪制散點圖，結果顯示炎癥早產組和非炎癥早產組間共篩選出365種差異表達的circRNA，其中差異表達上調有206種，差異表達下調有159種，見圖2。

圖2 差異表達circ RNA的散點圖 圖中每個散點代表1種circRNA表達信號，散點顏色由藍色向紅色漸變，代表不同circRNA在樣品中的表達量越高。高低綠色斜線為circRNA差異表達倍數的閾值線（差異倍數=±1.5），即綠色高線之上的點為差異表達上調1.5倍以上的circRNA，共206種；綠色低線之下的點為差異表達下調1.5倍以上的circRNA，共159種。

2.3 差異表達circ RNA的數據分析

分別對差異表達上調和下調倍數最高的前10條circRNA進一步分析，發現差異表達的circRNA類型主要為外顯子circRNA、重疊區circRNA等，可參與轉錄、信號轉導、凋亡等眾多生物學過程。其中上調差異表達倍數最高為circRNA_45982，其差異表達倍數為3.41倍。下調差異表達倍數最高為circRNA_19038，其差異表達倍數為4.70倍。見表2～3。

表2 差異表達上調倍數最高的前10條circ RNA

2.4 circ RNA-miRNA共表達分析

通過miRNA靶預測軟件預測circRNA和miRNA相互作用的結合位點，結果顯示多個circRNA可調節多個目標miRNA，其中1個circRNA可作用數個miRNA，也可見多個circRNA作用1個miRNA。顯著差異表達4倍及以上的circRNA及其結合的miRNA見表4。

表3 差異表達下調倍數最高的前10條circ RNA

表4 差異表達4倍及以上的circ RNA及其結合的miRNA

3 討論

目前全球每年有1 200～1 600萬嬰兒早產，已成為嚴重的世界公共衛生問題［13］。我國是當今世界早產發生的第二大國，每年早產兒約110～150萬，其中早產引發的腦發育異常和損傷發生率較高，約40%～50%幸存者存在運動、認知等近遠期后遺癥，嚴重影響早產兒的生長和生活質量［13-14］。因此，深入探究其調控機制，并探索有效的防治措施，已成為急需解決的重要問題。

已有研究表明，中樞神經系統中存在大量的circRNA，這些circRNA不僅與神經系統發育、分化和生物學功能有密切關系，在腦損傷后神經系統的病變和功能失調中也發揮重要調控作用，如circRNA參與缺血性腦卒中、阿爾茲海默癥、抑郁癥等疾病的發展與調控［15-17］。隨著研究的深入，我們發現circRNA的獨特結構與功能優勢，與線性分子相比，circRNA具有多種調控機制：（1）細胞核內調控親本基因的轉錄。（2）作為競爭性內源RNA，與mRNA競爭miRNA的結合位點，從而調控mRNA的表達。（3）可以翻譯表達有效蛋白等［9］。因此，circRNA無疑是更具有潛力的新型臨床診斷標記物和潛在的治療靶點。而目前對于早產兒腦白質損傷、腦發育異常的相關circRNA研究甚少。

本研究首次采用微陣列基因芯片對炎癥誘導早產小鼠腦損傷相關的差異表達circRNA進行分析。共篩選出365種差異表達的circRNA，其中差異表達上調有206種，差異表達下調有159種。圖2結果顯示，腦損傷早產鼠腦組織中的circRNA表達譜發生明顯變化，其中4個下調circRNA的差異倍數達到4倍以上，下調差異表達倍數最高為cir‐cRNA_19038，其差異表達倍數達到4.70倍。這提示我們差異表達的circRNA很可能參與了早產小鼠腦損傷的發展和調控過程，尤其是circRNA_19038等下調基因可能發揮更重要的調控作用，需進一步研究其可能機制。

miRNA是一類在轉錄后通過與mRNA結合負性調節其表達的非編碼基因。有研究報道，在神經系統調節過程中，circRNA可作為miRNA的海綿吸附體，通過結合特定的miRNA來間接調控mRNA的表達，這對于維持正常腦功能至關重要［18］。為進一步闡明差異表達circRNA在早產小鼠腦損傷中的調控機制，本研究對差異表達倍數4倍以上的circRNA進行miRNA結合預測分析并發現，這些變化的circRNA均有多個串聯的結合位點結合多個特定的miRNA來影響miRNA對mRNA的調控，從而影響更多的生物過程，如轉錄、信號轉導、凋亡、細胞周期、炎癥反應等。其中，差異表達倍數最高的circRNA_19038可能通過結合miR-709、miR-669n、miR-1187、miR-574-5p和miR-466c-5p調控相關靶基因。據國外與上述miRNA相關文獻報道，miR-709可通過lncRNA Mtss1的靶向調控參與并調節腦出血后繼發炎癥性腦損傷的發生與發展［19］。Li等［20］證明miR-709可通過Wnt/β-catenin通路在脂多糖誘導的炎癥反應中發揮調節作用。這提示我們，circRNA_19038很可能通過結合miR-709在早產兒炎癥性腦損傷中發揮重要的調控作用。另有文獻發現，miR-669n可能通過調控基因Vegfa參與血管新生的過程［21］。Vegfa是神經系統發育中重要的調控基因，已有研究證實，Vegfa參與調節血管神經發生、神經元再生及分化過程，且參與多條與炎癥反應相關的通路［22］。本課題組前期研究已發現基因Vegfa可通過lncRNA-AK016022調控參與早產兒炎癥性腦損傷的發生發展［5-6］。因此，我們猜想circRNA_19038可能通過與miR-669n、miR-709的結合進一步調節下游靶基因Vegfa的表達，可將其作為下一步研究思路深入挖掘。

綜上所述，本研究證實炎癥作用使早產鼠腦組織中circRNA的水平發生明顯變化，并且篩選出差異表達的circRNA及相關miRNA，可以作為后續實驗的潛在調控點。本研究的局限性在于通過芯片篩選的差異表達circRNA尚未進行實驗驗證。下一步我們將對目標circRNA進行qRT-PCR驗證，并在此基礎上進一步尋找其下游作用通路及其靶基因，探索與Vegfa、Wnt/β-catenin、lncRNA等已知調控基因及通路的關系，設計早期體外靶向調控目標circRNA的可能性，為臨床提供改善早產兒腦損傷預后的新治療方法提供思路。