基于轉錄組的劍麻SSR標記開發與篩選

張燕梅 李俊峰 楊子平 鹿志偉 陸軍迎 周文釗

摘 ?要：本研究基于劍麻轉錄組測序獲得的70 110條Unigene序列，采用MISA 1.0軟件查找SSR位點，利用Primer 3.0設計SSR引物，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳技術對其中的100對SSR引物有效性進行驗證?？傆嫬@得了13 175個SSR位點，SSR的分布頻率為15.61%。70 110條Unigene序列總計包括60種重復基元，其中單核苷酸重復為主導重復類型（37.96%），其次是二核苷酸重復和三核苷酸重復，比例分別為32.92%和27.90%，四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復所占比例總計為1.21%。A/T、AG/CT和AGG/CCT分別為單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復的優勢基元。100對SSR引物中有68對引物可擴增出目標產物，其中18對引物在6份劍麻種質中表現出多態性，該結果為利用SSR分子標記技術開展劍麻種質資源鑒定、遺傳多樣性分析等奠定基礎。

關鍵詞：劍麻;轉錄組測序;SSR

中圖分類號：S563.8 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： In this study， the high-throughput sequencing of the transcriptome of sisal was used to seek SSR loci and de-velop SSR markers by MISA 1.0 and Primer 3.0 softwares， respectively， and preliminary primer verification and poly-morphic primer analysis were performed by vertical acrylamide gels. A total of 13 175 of SSR loci were found in the 70 110 unigene sequences. The SSR distribution frequency was 15.61%. In total， 60 repeat elements were obtained， among them， mono- nucleotides were the domiant repeat motif （37.96%）， followed by di-nucleotides （32.92%）， and tri-nucleotides repeats （27.90%）， the other repeat types occupied 1.21% in all. The most dominant mono-nucleotide， di-nucleotide and tri-nucleotide repeat motif was A/T， AG/CT and AAG/TTC， respectively. Among the 100 pairs of SSR primers randomly selected from the designed SSR primers of Rema No. 1， sixty-eight pairs of primers could amplify the expected size bands， and eighteen primers showed polymorphism among six sisal germplasms. The obtained primers would provide effective molecule markers for genetic diversity analysis and germplasm identification of sisal.

Keywords： sisal; RNA-seq; simple sequence repeats

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.009

劍麻是一種重要的熱帶纖維作物，有重要的經濟價值。由于劍麻自然條件下變異頻發且倍性復雜[1]，現有保存的種質資源中，主要是通過麻園選育、雜交和引種獲得，遺傳背景模糊，命名極不規范，有的很難從表型加以辨別，給劍麻種質資源的保存利用以及育種工作帶來極大不便。分子標記技術的出現給遺傳育種研究注入了新的活力，并且在劍麻品種鑒定以及遺傳多樣性分析等方面得到廣泛的應用[2-8]。

微衛星DNA（microsatellite DNA）又稱簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR），是由1～6個核苷酸為重復單位串聯而成的長達幾十個核苷酸的重復序列，按其來源可分為基因組SSR（gSSR）和表達序列標簽SSR（EST-SSR）。與其他分子標記相比，SSR標記具有多態性高、重復性好、共顯性遺傳等優點，可以區分純合子和雜合子，廣泛應用于遺傳多樣性分析[9]、種質資源鑒定[10]以及遺傳作圖[11]等領域。目前劍麻中報道的SSR引物僅有7對，由于劍麻SSR引物偏少，獲得的信息量有限，因此，開發劍麻SSR標記引物對開展劍麻遺傳研究十分必要。劍麻基因組較大（1Cx≈7.5 pg）[1]，基因組信息未知，在短時間內開發gSSR標記幾乎不可能，隨著生物信息學和測序技術的飛速發展，EST序列數據劇增，利用EST序列開發SSR標記引物成為可能，并且在其他物種中已有成功的報道[12]。鑒于此，本研究基于前期獲得的劍麻轉錄組序列，利用MISA軟件查找SSR位點，開發劍麻SSR標記引物，解決劍麻SSR標記引物缺乏等實際問題，同時為劍麻遺傳研究奠定基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?轉錄組數據來源 ?劍麻轉錄組序列主要來源于本課題前期獲得的‘熱麻1號的70 110個Unigenes序列。

1.1.2 ?植物材料 ?植物材料為一年生的‘H.11648‘肯1‘肯2‘熱麻1號‘無刺番麻和普通劍麻走莖苗。每份材料取3～5株，每株取1 g葉片等量混合后用于提取基因組DNA。

1.2 ?方法

1.2.1 ?DNA提取 ?DNA提取采用天澤公司的柱式植物DNAout試劑盒提取，實驗材料用液氮快速研磨后取少量粉末，加入裂解液，經抽提、漂洗后過柱，洗脫后4 ℃保存備用，具體操作參照試劑盒說明書。

1.2.2 ?SSR位點查找 ?采用MISA 1.0軟件對每個Unigene進行簡單序列重復（SSR）位點查找，SSR位點篩選參數為：單核苷酸的重復次數大于或等于10次，二核苷酸重復次數大于或等于6次，三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的重復次數大于或等于5次。

1.2.3 ?SSR引物開發 ?采用Primer Premier 3.0設計引物，引物長度18～25 bp，GC含量為40%～ 60%，退火溫度Tm為56～65 ℃，預期產物長度為100～300 bp，盡量避免二聚體和發卡結構。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.4 ?SSR引物有效性驗證 ?隨機選取100對SSR引物，以‘H.11648‘肯1‘肯2‘熱麻1號‘無刺番麻和普通劍麻等6份種質的基因組DNA混合池為模板，進行PCR擴增，擴增產物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，150 V，2.5 h后取下膠板，銀染后拍照保存。PCR擴增程序為：首先94 ℃（15 s），60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，16個循環，每個循環退火溫度降低0.7 ℃;然后進入下一個擴增階段：94 ℃ 15 s，50 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，15個循環，最后72 ℃延伸60 min，擴增產物加入1/3體積的上樣緩沖液，混勻后4 ℃保存備用。

1.2.5 ?SSR引物多態性篩選 ?分別以‘H.11648‘肯1‘肯2‘熱麻1號‘無刺番麻和普通劍麻等6份種質的基因組DNA為模板，對檢測有目標產物條帶的SSR引物進行擴增，擴增產物經8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染后拍照保存。擴增程序和檢測方法同SSR引物有效性驗證。

2 ?結果與分析

2.1 ?劍麻SSR位點的分布與數量

‘熱麻1號的70 110條Unigenes序列全長總計45 255 938 bp，經MISA分析后發現有10 946條Unigenes序列共含有13 175個SSR位點（1/3.43），SSR發生頻率（含SSR的Unigene數/總Unigene數）為15.61%，SSR出現頻率（SSR位點數/總Unigene數）為18.79%，其中有1 848條序列含有2個或2個以上的SSR位點，803個SSR位點以復合形式存在?！疅崧?號‘轉錄組SSR類型豐富，單核苷酸至六核苷酸重復均存在，其中單核苷酸為主導重復基元，比例為37.96%，其次是二核苷酸和三核苷酸重復，比例分別為32.92%和27.90%，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸比例較低，分別為1.03%、0.12%和0.06%。從基元重復次數來看（表1），‘熱麻1號轉錄組SSR單核苷酸重復中10～12次重復較多，占單核苷酸SSR的66.63%，二核苷酸至六核苷酸重復中5～9次重復較多，分別占二核苷酸的84.95%，三至六核苷酸的100%。

2.2 ?劍麻SSR基序頻率特征及重復類型

‘熱麻1號的13 175個SSR位點，共包含60種重復基元，其中單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重復基元數分別為2、4、10、23、13和8種。單核苷酸重復基元主要有A/T和C/G兩種類型，其中A/T類型4936個，占單核苷酸重復的98.70%。二核苷酸有AG/CT、AC/GT、AT/AT、CG/CG等4種重復類型，其中AG/CT最多，占二核苷酸重復類型的86.01%，CG/CG比例最低，為1.06%（圖1）。三核苷酸有10種重復類型，其中AAG/CTT、AGG/CCT、AGC/TCG、CCG/CGG所占比例較高，分別為21.68%、21.41%、14.99%、12.68%，ACT/AGT比例最低，為0.46%（圖1）。四核苷酸有23種重復類型，除AAAG（22.22%）、AAAT（19.26%）、AAAC（9.63%）、ACAT（8.89%）和AGCG（7.41%）外，其他每種類型數量均在1～5之間，出現頻率較低。五核苷酸和六核苷酸分別有13和8種重復類型，每種重復類型數量均為1。

2.3 ?SSR引物有效性驗證

利用6份劍麻種質基因組DNA混合池為模板，隨機選取100對SSR引物進行檢測分析，有68對引物可擴增出穩定的目標產物條帶，表明開發的SSR引物有效，且引物擴增效率為68%（圖2，表2）。

2.4 ?多態性SSR引物篩選

分別以6份劍麻種質基因組DNA為模板，對68對有目標產物條帶的SSR引物進行擴增，經聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測后篩選出18對有多態性的SSR引物，多態性比率為26.47%（圖3），多態性引物及其DNA序列見表3。

3 ?討論

劍麻作為熱區重要的經濟作物和景天酸代謝的模式物種，有非常重要的經濟和理論價值[13]。然而由于劍麻遺傳背景復雜，基因組信息缺乏，使?劍麻的遺傳改良研究相對滯后。本研究從‘熱麻1號的70 110條Unigene序列中搜索到13 175個SSR位點，分布于10 946條Unigene序列上，SSR出現頻率為18.79%，SSR發生頻率為15.61%，平均距離為3.43 kb。與其他植物相比，劍麻的出現頻率與水牛草（14.41%）[12]和不結球白菜（18.44%）[14]相當，高于小麥（7.41%）[15]，甜葉菊（2.26%）[16]和紅松（7.43%）[17]，白芷（13.18%）[18]等，但明顯低于芒果[19]，枇杷（22.02%）[20]和橡膠樹（35.58%）[21]，不同物種間SSR出現頻率不同主要與SSR搜索時使用的軟件工具，重復類型以及最小重復數，長度標準以及分析數據量的大小不同有關[22-23]。

本研究結果表明，劍麻轉錄組中單核苷酸SSR數量最多（37.96%），與紅松[17]和太行菊[24]等植物中報道的相似，與竹子[25]、老芒麥[26]、水牛草[12]以及水稻、小麥等單子葉植物[27]不同。除單核苷酸外，劍麻中二核苷酸SSR數量較多（32.93%），二核苷酸優勢重復基元為AG/CT，這與天麻[28]、小麥[27]、老芒麥[26]等大多數單子葉植物相同，Kumpatla等[23]對49種雙子葉植物SSR分析表明，二核苷酸重復為主導重復類型，其次為三核苷酸重復或單核苷酸重復，重復類型非冗余EST序列包含SSR數量排名前20的SSR重復基元進行分析發現，AG/GA/CT/TC為20種雙子葉植物樣本中的二核苷酸優勢重復基元，AAG/AGA/GAA/ CTT/TTC/TCT為三核苷酸優勢基元，這與本研究結果相似，Morgante等[27]和Varshney等[29]研究證實植物eSSR中AG/CT為二核苷酸重復的優勢重復基元，這與本研究結果非常吻合，但本研究中CG重復比例較低，而Morgante等[27]研究顯示AT重復比例較低。劍麻中三核苷酸比例次于單核苷酸和二核苷酸，以AAG/TTC、AGG/CCT為優勢基元。這與Morgante等[27]報道的在水稻、小麥、玉米等單子葉植物中三核苷酸比例最高且CCG為優勢基元結果不同，這種現象在多種植物中均有報道[23]。Kumpatla等[23]分析認為，不同物種間以及同一物種內主導核苷酸重復類型以及優勢基元不同，主要原因可能與SSR分析過程中采用的搜索工具、分析時設置的參數標準以及分析時數據量的大小等有關。此外，3UTR富含三核苷酸和四核苷酸，5UTR富含二核苷酸和三核苷酸，EST序列中3UTR和5UTR的比例對核苷酸重復類型也存在影響。

綜上所述，本研究利用現有的劍麻EST-SSR序列開發SSR標記引物是可行且有效的，并且本研究結果是對劍麻SSR引物的一個很好補充，利用篩選的18對SSR引物可以開展劍麻種質資源鑒定、遺傳多樣性分析以及親本鑒定研究，若要開展劍麻遺傳圖譜構建和比較作圖等，還需要篩選更多的SSR引物。

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責任編輯：黃東杰