結直腸癌類器官生物樣本庫的建立和應用研究進展

王一 吳小倩 黃偉芳 裴斌 尚芳 孔德松 王小峰朱勇 姚航 劉飛 樊志敏

結直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，在我國惡性腫瘤發病率中位居第三位，僅次于肺癌和胃癌，死亡率居第五位，已高于發展中國家以及世界平均水平［1-3］。目前結直腸癌的治療方式主要還是依靠手術和放、化療，雖然生物制劑、免疫治療等輔助治療正在不斷出現［4-5］，但療效依然較為有限。以往結直腸癌的研究主要依靠細胞模型和動物模型，但這些模型都存在一定的局限性。而類器官（organoid）模型的出現使得我們可以在體外更加高效且真實地模擬腫瘤在體內的各方面特性，為基礎研究及其向臨床應用的轉化提供了更加先進的工具和橋梁。

一、類器官的出現和發展

2009年，Hans Clevers團隊在Nature雜志上發表突破性成果，首次在外體培育出了結直腸上皮類器官［6］。文中，研究者將腸上皮組織消化為腸隱窩結構或單個Lgr5+干細胞，并包裹于基質膠（matrigel）中，再加入含有表皮細胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）、Wnt信號通路相關蛋白R-spondin 1、Noggin蛋白的培養基進行培養。由于Matrigel具有支撐作用，利用腸隱窩底部Lgr5+干細胞的增殖分化能力，消化獲得的腸隱窩結構或單個Lgr5+干細胞能夠向各個方向生長，從而形成了包含腸上皮隱窩和絨毛樣結構的3D組織球。經免疫熒光染色、免疫組化及電鏡觀察，發現其中包含了腸上皮細胞、杯狀細胞、潘氏細胞、腸內分泌細胞以及Lgr5+干細胞等多種細胞種類，并具有腸上皮相似的結構。

至2014年，已有包括腸、肝、胃、腦、腎、心臟、皮膚等在內的多種器官被成功培育出類器官模型［7-11］。這些類器官模型的共同特點都包括：由相應供體器官的多種特征性細胞構成，相比單細胞模型能夠更好地模擬供體器官的特性；具有供體器官的部分功能，如排泄、過濾、收縮、神經活動等；與供體器官具有相似的組織排列形態和空間結構。基于此，類器官模型相比傳統的細胞和動物模型展現出了諸多優勢，并且由于其建立更為簡便高效，可能成為傳統模型難以解決的科學問題的新型研究工具。例如人腦類器官可以用于研究神經干細胞獨特的分裂方式［10］；視網膜類器官已被用于研究人與實驗動物視網膜組織形態發生的區別［12］；胃腸道類器官則已被用于研究人與實驗動物胃腸道各器官在發育過程中功能的協調發展［13］。此外類器官在多種疾病的發生機制及治療的研究中也具有很大的潛力，可以構建疾病模型，進行化療藥物敏感性及安全性測試等。除了使用臨床組織樣本培養類器官，目前已有研究團隊成功構建了利用分化的人胚胎干細胞以及誘導多能干細胞誘導培養結腸類器官的體系，為未來類器官的發展提供了更多的可能［14］。

二、結直腸癌類器官生物樣本庫的建立和發展

在以往的癌癥研究中，細胞系是最常用的體外模型，可以進行高通量的藥物敏感性測試并將其與基因組的改變相關聯［15］。但細胞系往往已經失去原始供體的基因組特征，不具備個體異質性，這給精確預測具體患者對特定藥物的敏感性帶來了困難。運用人源腫瘤異種移植模型（patientderived tumor xenograft，PDX）可以很好地解決這一問題，將供體的原位腫瘤移植入免疫缺陷動物，可最大化地保留供體的異質性［16］。但PDX模型的建立需要時間較長，且需要高昂的費用，不利于高通量的藥物篩選。2015年，Hans Clevers團隊首次建立了結直腸癌類器官生物樣本庫［17］，他們用27例手術切除的結直腸癌樣本成功培育出了22例結直腸癌類器官，總體成功率達90%，并且經傳代后均可凍存，復蘇后的成活率可達80%以上。通過對供體組織樣本及所培養的類器官進行固定、切片及H & E染色后對比發現，正常腸上皮組織來源的類器官形態較規則，中空有腔并有絨毛、隱窩樣結構。而結直腸癌組織來源的類器官則很大程度上保留了供體組織的形態學特征，如薄壁的囊性結構或沒有空腔的緊密型結構。之后分別提取類器官及其相應供體活檢組織的基因組DNA，進行全外顯子組測序，發現類器官每Mb堿基對的平均突變率與供體活檢組織相似，且突變主要為CpG向T的突變，與結直腸癌的大規模測序結果相一致。轉錄組分析顯示不同類器官在基因表達上具有細微的差異，說明了類器官之間具有異質性。基于此，Hans Clevers團隊組織成立了非盈利機構Hubrecht Organioid Technology（HUB），以進一步擴大結直腸癌和其他類型類器官生物樣本庫的規模。

此后，又有多個結直腸癌樣本庫被建成［17-24］（見表1），進一步證明了類器官模型可以用于結直腸癌患者個體水平的基因組及其功能的研究，且具有耗時短、高通量的特點，這是傳統細胞系模型及PDX模型所無法做到的。并且由于類器官可以很好地保留供體組織的異質性，可以用于高通量的高敏感度的藥物敏感性檢測，為結直腸癌患者制定個性化的治療方案，具有很高的應用價值。

表1 目前結直腸癌類器官生物樣本庫建設情況

三、結直腸癌類器官生物樣本庫的應用

1.抗結直腸癌藥物的開發

近年來，由于法規的完善以及越來越嚴格的臨床試驗標準，前期基礎研究所開發的抗癌藥物大部分無法通過臨床試驗最終進入臨床使用，導致研發成本急劇升高。其中影響最為顯著的因素是在藥物的前期開發過程中沒有合適的臨床前模型進行藥物療效的評價，導致多數藥物雖然在基礎研究中顯示出良好的效果，但應用于人體后卻無法達到滿意的療效。通過收集臨床樣本建立大型結直腸癌類器官生物樣本庫，并記錄每個患者的基線資料，除了可以對這些類器官進行基因組測序和表達譜分析外，在抗癌藥物開發的基礎和臨床研究中可以起到重要的作用，可以幫助發現新穎的抗癌化合物，探索全新的治療策略。使用類器官模型進行抗癌藥物的開發能夠更好地模擬人體對于藥物的反應，更準確地評價治療效果，減少后期臨床試驗失敗的風險，同時節省研發時間，降低研發成本，目前已經得到了越來越廣泛的使用［25］。

2.藥物敏感性檢測與個體化治療

類器官作為極具潛力的臨床前模型，在藥物敏感性檢測方面已有較多應用。Schutte等［19］建立了1個大型結直腸癌生物樣本庫，其中包含了35例類器官樣本及59例PDX樣本，并通過基因組測序驗證了這些模型都很好地反應了供體腫瘤組織的表型特征。此研究發現了不同來源腫瘤的異質性如EGFR、PTCH1等基因的突變可能影響到藥物的治療效果，這也印證了類器官模型對供體組織異質性的保留。Ganesh等［21］建立了包含65例直腸癌類器官的樣本庫，進行體外放化療干預后的類器官模型顯示出了與臨床患者相一致的反應。并且將類器官移植入實驗動物體內再進行相同手段干預后，可以觀察到相一致的結果，顯示出了類器官模型在藥敏檢測中良好的應用前景。Yao等［23］運用局部進展期直腸癌（LARC）且接受了新輔助放化療（NACR）患者的臨床組織樣本構建了包含80例類器官的生物樣本庫，基于此樣本庫發現類器官可以預測患者對放療、5-Fu、CPT-11的敏感性，識別適合進行新輔助放化療的患者，指導臨床治療。對于部分對放化療不敏感的患者，類器官也可以幫助選擇合適的靶向藥物或新型藥物，避免過度治療并減少治療的副作用。該研究所進行的類器官培養及干預反應檢測均可以在4周內完成，證明了類器官模型可以在短時間內對臨床用藥作出有意義的指導。Vlachogiannis等［20］構建了包含24例結直腸癌類器官在內的生物樣本庫，經過對類器官模型、動物移植瘤模型藥敏檢測結果以及臨床患者藥物反應進行比較，發現類器官預測患者對靶向藥物或化療藥物的反應具有100%的敏感性和93%的特異性，準確性達到88%，且具有100%的陰性預測率。Narasimhan等［26］對腹膜轉移的結直腸癌組織進行類器官培養，并進行基因測序及中通量藥敏測試。結果發現藥物對腹膜轉移的結直腸癌的反應性與患者特定的基因組改變相一致，顯示類器官平臺可以作為藥敏檢測的平臺，從而指導預后不良的結直腸癌患者進行個體化治療。總而言之，在臨床實踐中對于需要進行化療或靶向藥物治療的結直腸癌患者，可以對其活檢或手術切除組織進行類器官培養，高通量的進行藥物敏感性檢測，針對個體選擇更為敏感的藥物組合方案，從而提高治療的效果，更符合個體化治療的發展趨勢，具有很高的臨床應用價值。

3.在基礎研究中的應用

由于結直腸癌是一種異質性疾病，不同患者的臨床表現和預后都各不相同，所以類器官在結直腸癌發生與發展的基礎研究中有很高的應用前景。Fujii等［18］構建了包含55例樣本的結直腸癌生物樣本庫，其供體組織包含了多種組織學亞型及臨床階段。無論在體外培養或移植到免疫缺陷小鼠體內培養，類器官均表現出了與供體組織相似的病理分期和分化能力。在結直腸腫瘤從正常組織向腺瘤轉變以及從腺瘤組織向腺癌轉變的過程中，對局部微環境的依賴性降低，產生這種變化主要是由基因突變導致的，且能夠加速局部的癌變過程。而對于進展期的結直腸癌類器官，其生物學行為的改變如對BMP/TGF-β的抵抗以及獲得轉移的能力，被發現與基因組的改變沒有直接的關聯。未來利用更先進的基因分析技術可能會發現對結直腸癌進展有重大影響的遺傳學改變，而類器官模型則可以成為連接生物學與遺傳學的主要橋梁。早發性結直腸癌（EOCRC）的預后較差，且難以用細胞和動物模型進行研究。Drost等［27］運用CRISPR-Cas9技術在人結直腸類器官上對最常見的結直腸癌突變基因進行靶向修飾，證實類器官模型可以作為結直腸癌發生研究的重要工具。Takeda等［28］則運用CRISPRCas9技術干預結直腸癌類器官，構建了對結直腸癌發生相關基因進行功能驗證的平臺，并且可以進一步推廣至其他類型的腫瘤中。Yan等［24］利用EOCRC患者的臨床組織樣本培養了49例類器官，并對其進行了外顯子組及轉錄組測序，尋找EOCRC中的關鍵突變以及轉錄組的變化。該團隊發現了在EOCRC類器官中就包含了PTPRK-RSPO3融合在內的多種表型特征。而從轉錄角度，與APC突變型類器官相比，RSPO融合型與正常腸組織類器官更為相似，表現為BMP2高表達且依賴于BMP/SMAD通路的失活，且表達較少的干細胞標志物PTK7，單細胞轉錄組分析也證實了這一結果。通過對EOCRC和正常腸類器官的長期培養，相較于正常腸癌類器官，EOCRC類器官的穩定性更強，這一特性對CRISPR-Cas9技術的合理使用有所幫助。此外，這些發現對正在進行臨床試驗的Wnt分泌抑制劑、RSPO、PTK7靶向藥物對RSPO融合型及APC突變型結直腸癌的不同應用作出了一定的指導作用。

四、小結

結直腸癌類器官生物樣本庫的建立和應用為結直腸癌的基礎研究、藥物開發、個體化治療提供了更為可靠的工具，相較于傳統的疾病模型具有諸多優勢。但結直腸癌類器官生物樣本庫的進一步推廣應用仍存在一定的挑戰。例如類器官培養的技術相對復雜，對技術人員的操作要求較高；類器官培養雖然相較于構建PDX模型成本較低，但建立大規模的生物樣本庫仍然需要較高的費用投入；目前結直腸癌類器官主要以上皮組織培養為主，還缺乏成熟的包含基質及免疫系統的培養體系，需要進一步研究探索。總而言之，類器官技術的出現以及結直腸癌類器官生物樣本庫的建立和應用有望建立結直腸癌基礎研究與臨床試驗的直接聯系，補充以細胞系和PDX模型為基礎的藥物研究的不足，進一步推動結直腸癌的個體化治療。