桑枝多糖基于YAP/TAZ 信號通路調控db/db 小鼠腎纖維化作用的研究

余文勝 黃 飛 鄭 妮

糖尿病腎病（DN）是糖尿病常見的、嚴重的微血管并發癥，且超過三分之一的糖尿病患者伴發DN，并最終發展為終末期腎臟疾病（ESRD），成為糖尿病致死、致殘的主要因素[1]。DN 臨床治療較為棘手，且尚缺乏特異性、針對性的治療藥物，目前主要以血糖控制為基礎，聯合抗氧化、血管緊張素轉化酶抑制劑和鈣拮抗劑等藥物進行綜合治療，但從臨床療效上看，目前的治療方案只是減緩腎功能減退及腎纖維化的發展，仍難以阻止其病程進展[2-3]。

桑枝Mori Ramulus 是桑科植物桑Morus alba L.的干燥樹枝，具有祛風活絡、通利關節、燥濕利水、降血糖降血脂以及提高機體免疫功能等多種藥效[4-5]。桑枝多糖為桑枝的主要成分之一，課題組前期研究結果表明，桑枝多糖具有良好降血糖，增強糖尿病小鼠腎臟抗氧化能力，改善氧化應激對腎組織損傷的作用[6]，但其對DN 的作用機制并未完全闡明。本研究以自發型2 型糖尿病db/db 小鼠為DN 模型，探究桑枝多糖對DN 的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動 物 24 周齡db/db 小鼠40 只，db/m 小鼠10 只，SPF 級，雌雄各半，體質量（47.27±1.62）g，購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，實驗動物使用許可證：SYXK（蘇）2018-0027，實驗動物生產許可證：SYXK（蘇）2018-0008。小鼠飼養于通風良好的環境，室溫18～25℃，相對濕度40～70%，12h 光照晝夜循環。

1.2 藥 物 本研究應用的桑枝經廣西中醫藥研究所鑒定。桑枝多糖制備[7]：干燥桑枝1kg，粉碎成粗粉，使用6000mL 80%的乙醇溶液，85℃下回流提取4次，每次2h，過濾，濾液減壓至無醇味，加2000mL 雙蒸水，煮3 次，每次2h，過濾，合并濾液，10000pr/min離心10min，用微波真空干燥器濃縮，得濃縮液250mL，經氯仿-正丁醇（5∶1）多次萃取后除去蛋白質。提取液4℃過夜，10000pr/min 離心10min，過濾，加入5 倍量95%乙醇，使乙醇終濃度為70%，醇沉24h，抽濾，收集藥渣，濾渣依次用乙醚、無水乙醇、丙酮洗滌3 次，所得藥渣定性測定含粗多糖。將多糖粗品溶于水，加樣到經PBS 緩沖液（pH=7.8）處理的樹脂層析柱中，靜止12h，用雙蒸水以2mL/min 流速進行洗脫，合并洗脫液，真空干燥得桑枝多糖。經紫外-可見分光計測定樣品中的桑枝多糖純度達85.6%；纈沙坦，海南皇隆制藥股份有限公司，批號191205。

1.3 試 劑 腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）、纖維連接蛋白（FN）、膠原Ⅰ型（CollagenⅠ）ELISA 試劑盒，上海酶聯生物科技有限公司，批號200720、200811、200705、200716、200818；單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、結締組織生長因子（CTGF）ELISA 試劑盒，圣克魯斯生物技術（上海）有限公司，批號Sc-52734、Sc- 102086；兔抗人Yes 相關蛋白（YAP）、TEAD 多克隆抗體，美國Cell Signaling Technology 公司，批號20271、20397。

1.4 主要儀器 9602A-酶標儀（北京艾普生設備有限公司）；全自動生化分析儀（日立公司，7100）；Gel doc200 低溫高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；垂直電泳儀（BIO-RAD 公司）；轉膜及顯影設備（BIORAD 公司）；羅氏卓越型血糖儀（ACCU-CHEK Performa）。

2 實驗方法

2.1 動物分組及給藥 自發型2 型糖尿病24 周齡db/db 小鼠40 只，24 周齡db/m 小鼠10 只，均雌雄各半。使用隨機數字表法將db/db 小鼠分為模型組、纈沙坦組（20mg/kg）、桑枝多糖低劑量組（600mg/kg）、桑枝多糖高劑量組（1200mg/kg），每組10 只，日常進行高脂飲食喂養，連續灌胃相應藥物60 天，每天1 次。db/m 小鼠為空白組，日常進行普通飼料喂養，模型組與空白組小鼠灌胃等體積生理鹽水60 天。

2.2 HE 染色方法 將制作好的腎臟蠟塊切片，切片厚度4μm，切片用二甲苯脫蠟，置于二甲苯與純乙醇混合液中，乙醇逐級脫水，蘇木精染液染色，水洗及0.5%鹽酸乙醇分色，蒸餾流水沖洗，伊紅染液染色，乙醇逐級脫水后二甲苯透明，封片。觀察小鼠腎組織病理學變化。

2.3 生化指標檢測 于第60 天采集小鼠尿液，測量尿量，采用終點法測24h 尿白蛋白（UP）含量；末次給藥后，小鼠禁食不禁水12h，使用血糖儀檢測小鼠空腹血糖（FBG）；眼眶靜脈取血，高速冷凍離心分離血清，使用全自動生化分析儀測定小鼠血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）含量。

2.4 ELISA 法檢測小鼠腎組織纖維化指標 剝離小鼠腎組織，低溫條件下將其制成約10%的勻漿液，按ELISA 試劑盒說明書操作，檢測小鼠腎組織TGFβ1、FN、CTGF、CollagenⅠ表達及炎癥因子TNF-α、IL-6、MCP-1 表達量。

2.5 蛋白免疫印跡法檢測小鼠腎組織YAP、TAZ 表達量 剝離小鼠腎組織，低溫條件下將其制成約10%的勻漿液，冰浴靜置30min，高速冷凍離心機中離心5min，分離上清液，提取腎組織總蛋白。在SDSPAGE 膠上加入Marker 及檢測蛋白，轉移至PVDF膜后加5%脫脂奶粉，洗膜，加入一抗（1∶500），4℃低溫環境下孵育過夜，洗膜，加入稀釋的二抗（1∶2000），低溫靜置孵育60min，洗膜，暗室中曝光顯影。電泳成像分析系統掃描、分析蛋白條帶。

3 實驗結果

3.1 桑枝多糖對db/db 小鼠FBG 的影響 與空白組比較，給藥前各組小鼠FBG 均明顯上升，給藥后，桑枝多糖低、高劑量組小鼠FBG 有所下降，但仍高于空白組（P<0.05）。與模型組給藥后比較，纈沙坦組小鼠FBG 無明顯改變（P>0.05），桑枝多糖低、高劑量組小鼠給FBG 均明顯降低（P 均<0.05）。見表1。

表1 桑枝多糖對db/db 小鼠FBG 的影響（mmol/L，）

表1 桑枝多糖對db/db 小鼠FBG 的影響（mmol/L，）

注：空白組為db/m 小鼠，予生理鹽水；模型組為自發型2 型糖尿病db/db 小鼠，予生理鹽水；纈沙坦組為自發型2 型糖尿病db/db 小鼠予20mg/kg 纈沙坦混懸液；桑枝多糖低劑量組為自發型2 型糖尿病db/db 小鼠予600mg/kg 桑枝多糖混懸液；桑枝多糖高劑量組為自發型2型糖尿病db/db 小鼠予1200mg/kg 桑枝多糖混懸液；FBG 為空腹血糖；與空白組同期比較，aP<0.05；與本組給藥前比較，bP<0.05；與模型組給藥后比較，cP<0.05

3.2 桑枝多糖對db/db 小鼠24h 尿量、UP 及血清Scr、BUN 的影響 與空白組比較，模型組小鼠24h尿量、UP 含量及血清Scr、BUN 含量明顯升高（P 均<0.05）。與模型組比較，纈沙坦組及桑枝多糖低、高劑量組小鼠24h 尿量、UP 含量及血清Scr、BUN 含量均明顯降低（P 均<0.05）。見表2。

表2 桑枝多糖對db/db 小鼠24h 尿量、UP 及血清Scr、BUN 的影響（）

表2 桑枝多糖對db/db 小鼠24h 尿量、UP 及血清Scr、BUN 的影響（）

注：空白組為db/m 小鼠，予生理鹽水；模型組為自發型2 型糖尿病db/db 小鼠，予生理鹽水；纈沙坦組為自發型2 型糖尿病db/db 小鼠予20mg/kg纈沙坦混懸液；桑枝多糖低劑量組為自發型2 型糖尿病db/db 小鼠予600mg/kg 桑枝多糖混懸液；桑枝多糖高劑量組為自發型2 型糖尿病db/db 小鼠予1200mg/kg 桑枝多糖混懸液；UP 為尿白蛋白；Scr 為血清肌酐；BUN 為尿素氮；與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

3.3 桑枝多糖對db/db 小鼠腎組織病理學變化 腎臟病理切片結果顯示，空白組小鼠腎小球數量多，分布廣泛，其結構飽滿完整。模型組小鼠腎小球囊腔內皺縮嚴重，腎小球基底膜均質性增厚且出現大量空泡及細胞核固縮現象，數量較少。纈沙坦及桑枝多糖低、高劑量組小鼠腎小球囊腔皺縮程度減少，仍有空泡出現，腎小球數量較模型組多。見圖1。

圖1 桑枝多糖對db/db 小鼠腎組織病理學變化（HE 染色×400）

3.4 桑枝多糖對db/db 小鼠腎組織炎癥因子、趨化因子的影響 與空白組比較，模型組小鼠腎組織炎癥因子TNF-α、IL-6、MCP-1 含量顯著升高（P 均<0.05）。與模型組比較，纈沙坦組及桑枝多糖低、高劑量組小鼠腎臟TNF-α、IL-6、MCP-1 含量明顯降低（P 均<0.05）。見表3。

表3 桑枝多糖對db/db 小鼠腎組織炎癥因子、趨化因子的影響（ng/L，）

表3 桑枝多糖對db/db 小鼠腎組織炎癥因子、趨化因子的影響（ng/L，）

注：空白組為db/m 小鼠，予生理鹽水；模型組為自發型2 型糖尿病db/db 小鼠，予生理鹽水；纈沙坦組為自發型2 型糖尿病db/db 小鼠予20mg/kg 纈沙坦混懸液；桑枝多糖低劑量組為自發型2 型糖尿病db/db 小鼠予600mg/kg 桑枝多糖混懸液；桑枝多糖高劑量組為自發型2型糖尿病db/db 小鼠予1200mg/kg 桑枝多糖混懸液；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-6 為白介素-6；MCP-1 為單核細胞趨化蛋白-1；與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

3.5 桑枝多糖對db/db 小鼠腎組織纖維指標的影響與空白組比較，模型組小鼠腎組織TGF-β1、FN、CTGF、CollagenⅠ含量顯著升高（P 均<0.05）。與模型組比較，纈沙坦組及桑枝多糖低、高劑量小鼠腎臟TGF-β1、FN、CTGF、CollagenⅠ含量明顯降低（P 均<0.05）。見表4。

表4 桑枝多糖對db/db 小鼠腎組織纖維指標的影響（ng/mL，）

表4 桑枝多糖對db/db 小鼠腎組織纖維指標的影響（ng/mL，）

3.6 桑枝多糖對db/db 小鼠腎組織YAP、TAZ 表達的影響 與空白組比較，模型組小鼠腎組織YAP、TAZ 蛋白表達顯著增加（P 均<0.05）。與模型組比較，纈沙坦組及桑枝多糖低、高劑量小鼠腎組織YAP、TAZ 蛋白表達降低（P<0.05）。見表5、圖2。

圖2 桑枝多糖對db/db 小鼠腎組織YAP、TAZ 表達的影響

表5 桑枝多糖對db/db 小鼠腎組織YAP、TAZ 表達的影響（）

表5 桑枝多糖對db/db 小鼠腎組織YAP、TAZ 表達的影響（）

4 討論

DN 發病機制復雜，主要由于長期的高血糖影響，造成腎小球血流動力學的改變、引起腎小球高壓，腎臟系膜細胞受刺激后增殖、肥大，使基質增生[8]。同時腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS）的過度活躍和大量活性氧、炎癥因子的生成，導致腎小球足細胞損傷、提高腎臟細胞外基質（ECM）的增殖水平，促使腎臟的炎癥及纖維化的發生[9]。腎臟纖維化是DN 進入終末期的病理過程，其病程一般分為五期，主要以腎小球濾過率、腎小球毛細血管基底膜的厚度及寬度、蛋白尿、腎小管間質纖維化、腎小球硬化等指標判斷病程的發展。

腎小球和腎小管的巨噬細胞炎性浸潤及其大量聚集，是糖尿病腎損傷的主要病理特征[10]。在高糖環境下，單核細胞在黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及趨化蛋白MCP-1 的作用下遷移到腎臟微環境，分化為巨噬細胞及進一步活化，釋放炎癥因子TNF-α、IL-6及纖維化因子TGF-β1 等細胞因子，加重腎組織的炎癥反應，誘導腎臟局部慢性亞臨床腎炎，促使腎小球系膜細胞對ECM 的分泌增加，進而引起成纖維細胞的增殖，系膜細胞外基質沉淀腎小球硬化及間質纖維化，促進糖尿病腎纖維化的發展[11-12]。

YAP/TAZ 復合物是對進化上有著高度保守的Hippo 信號通路的核心元件，其對器官大小的調控，腎臟成纖維細胞增生，肌成纖維細胞生成、分化、凋亡等重要的生物學過程均發揮著重要的作用。其中YAP 是調節細胞的增殖、分化及介導上皮間質轉化的關鍵因子。腎臟正常狀態下，磷酸化的YAP 與14-3-3 調控蛋白結合，調控CTGF、FN、CollagenⅠ等下游靶因子的表達，維持細胞生存平衡[13]。腎臟高糖內環境下，去磷酸化的YAP 會從細胞質向細胞核遷移且活化，與組織TEAD 相互作用，激活重要的纖維因子CTGF，促進細胞增殖和細胞外基質合成，以腎纖維化的方式修復慢性腎臟疾病的腎臟損傷[14]。TAZ 是YAP 的同源蛋白，在DN 的進展中發揮重要作用。研究表明，TAZ 在腎臟足細胞和腎小管上皮細胞的高表達，可激活纖維蛋白CTGF 的表達，進一步加重DN 的腎纖維化[15]。另外，由于YAP 誘導腎小管TGFβ1 表達，進而刺激HK-2 細胞，導致TAZ 蛋白表達增加，引發HK-2 細胞的增殖缺陷，介導細胞增殖和細胞外基質合成及腎纖維化的形成[16]。

實驗結果表明，桑枝多糖能有效改善DN 小鼠腎功能及腎組織的病理變化，減低腎臟間質纖維化指標TGF-β1、FN、CTGF、CollagenⅠ、炎癥因子TNFα、IL-6 及趨化蛋白MCP-1 含量，以減緩腎臟間質纖維的形成；同時降低腎組織YAP、TAZ 表達。提示，桑枝多糖可能通過調節腎組織YAP、TAZ 的蛋白表達，及抑制YAP/TAZ 信號通路下游的趨化蛋白MCP-1、纖維化指標TGF-β1、FN、CTGF、CollagenⅠ及炎癥因子TNF-α、IL-6 生成，減緩腎臟間質纖維的形成及炎癥因子對腎組織的攻擊損害，降低細胞外基質合成，達到抗纖維化的作用。