南極菲爾德斯半島土壤微生物在富集傳代培養(yǎng)中對菲的響應(yīng)*

李淑君 崔志松 包木太 欒 曉 李穎超 鄭 立

南極菲爾德斯半島土壤微生物在富集傳代培養(yǎng)中對菲的響應(yīng)*

李淑君1, 2崔志松2①包木太1①欒 曉3李穎超2鄭 立2

(1.中國海洋大學(xué)深海圈層與地球系統(tǒng)前沿科學(xué)中心/海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點實驗室/化學(xué)化工學(xué)院 青島 266100; 2.自然資源部第一海洋研究所海洋生物資源與環(huán)境研究中心 青島 266061; 3.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境水質(zhì)學(xué)國家重點實驗室 北京 100085)

為揭示富集傳代培養(yǎng)過程中南極多環(huán)芳烴降解菌群的演替規(guī)律, 以菲為唯一碳源和能源對南極菲爾德斯半島不同地理位置的6份土壤樣品進行了富集和連續(xù)傳代培養(yǎng), 并采用高通量測序技術(shù)分析了富集傳代培養(yǎng)過程中菲降解菌群的群落結(jié)構(gòu)及生物多樣性。Alpha多樣性分析結(jié)果表明, 在富集培養(yǎng)階段南極菲降解菌的物種豐富度顯著高于傳代培養(yǎng)階段(<0.05), 但傳代培養(yǎng)階段的代際物種豐富度無顯著差異(>0.05)。Beta多樣性分析結(jié)果表明富集培養(yǎng)階段與傳代培養(yǎng)階段的群落結(jié)構(gòu)具有顯著性差異(<0.05), 但傳代培養(yǎng)階段菲降解菌群趨于相對穩(wěn)定, 代際間群落結(jié)構(gòu)無顯著性差異(>0.05)。大量微生物在富集培養(yǎng)階段豐度較高, 但因不能適應(yīng)實驗室培養(yǎng)條件或不能利用菲而在傳代培養(yǎng)階段被淘汰。反之, 假單胞菌屬()、鞘氨醇菌屬()、貪噬菌屬()、甲基嬌養(yǎng)桿菌屬()和產(chǎn)堿桿菌屬()等適應(yīng)了該選擇壓力并在傳代培養(yǎng)階段形成了動態(tài)平衡的優(yōu)勢種群。此外,、和等在富集傳代培養(yǎng)過程中具有顯著性差異的優(yōu)勢種在維持群落的動態(tài)平衡中也發(fā)揮著重要的作用。該研究有助于加深人們對南極土壤環(huán)境中持久性有機污染物的降解潛力以及關(guān)鍵微生物動態(tài)變化的認(rèn)識, 為下一步充分挖掘利用南極環(huán)保功能微生物資源提供重要的依據(jù)。

南極; 土壤; 菲; 富集; 傳代; 微生物多樣性

南極長年為冰雪所覆蓋, 被認(rèn)為是最后一塊原始的大陸。但隨著人類科考、旅游活動的增加, 南極環(huán)境不可避免的受到污染, 其中石油烴是最主要的污染物之一(Bargagli, 2008)。石油烴中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、毒性強、難降解的有機污染物以多環(huán)芳烴類化合物(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)為主。譬如, 南極考察站通常使用柴油作為燃料, 而柴油中含有高達(dá)20%的PAHs (Lee, 1992)。同時, PAHs還具有半揮發(fā)性, 容易隨大氣傳輸, 即所謂的“全球蒸餾”效應(yīng)(又稱“蚱蜢跳”效應(yīng)) (Gouin, 2004), 從低緯度地區(qū)長距離遷移到偏遠(yuǎn)的極地地區(qū)。PAHs因其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和熱力學(xué)穩(wěn)定性可在環(huán)境中廣泛持久地存在, 不易被降解(Phillips, 1983)。但通過前期研究發(fā)現(xiàn)極端環(huán)境中蘊藏著具有污染物分解能力的微生物資源, 土著微生物能夠更好地適應(yīng)本地生態(tài)環(huán)境條件, 可以被有效應(yīng)用于原生環(huán)境的污染物修復(fù)和處理(曾獻春等, 2016)。

菲爾德斯半島位于南設(shè)德蘭群島的喬治王島西南端(58°57′51.9″W, 62°12′59.7″S), 具有獨特的氣候及地理特征, 沒有大型植物生長, 形成了以地衣、苔原和微生物為優(yōu)勢物種的生態(tài)系統(tǒng)(Campbell, 2004)。與其他地區(qū)相比, 微生物是該生態(tài)系統(tǒng)的主要組成部分, 有時甚至是唯一的組成部分(Chong, 2009; Levin, 2013)。因此, 南極菲爾德斯半島是研究微生物多樣性的理想場所之一, 以該地區(qū)的土壤為研究對象有利于豐富對南極特殊環(huán)境中PAHs降解菌多樣性的認(rèn)識。

目前對南極PAHs降解菌的研究大多數(shù)是“快照式(snapshot)”的, 按研究方法分為依賴培養(yǎng)的技術(shù)體系和不依賴培養(yǎng)的技術(shù)體系。例如, Ma等(2006)多次利用可培養(yǎng)方法對南極PAHs降解菌進行分離和鑒定, 并獲取了一些新屬或新種的純培養(yǎng)物。Muangchinda等(2015)利用常規(guī)PCR、real-time PCR、克隆和測序等分子生物學(xué)方法, 對南極土壤和沉積物中芳烴降解功能基因的豐度和多樣性進行了研究。然而, 大家對南極PAHs降解菌群在時間序列上的動態(tài)變化卻知之甚少。研究富集傳代培養(yǎng)過程中PAHs降解菌群的物種組成及其動態(tài)變化, 不僅可以揭示富集傳代培養(yǎng)過程中PAHs降解菌群隨時間變化的規(guī)律, 還可分析確定南極土壤中降解PAHs的關(guān)鍵微生物類群, 有利于指導(dǎo)依賴培養(yǎng)的方法體系進行靶向性篩選, 提高南極特殊環(huán)境中菲降解菌的菌種分離效率, 為南極污染環(huán)境的生物修復(fù)提供有效的技術(shù)支持。

本研究以典型PAHs化合物菲為唯一碳源和能源對中國第35次南極科學(xué)考察采自菲爾德斯半島6個站點的土壤樣本進行富集傳代培養(yǎng)獲得菲降解菌群。通過16S rRNA基因高通量測序?qū)Ψ平到饩焊患瘋鞔囵B(yǎng)過程中的群落組成動態(tài)變化及多樣性進行研究, 分析菲降解菌群代際微生物群落結(jié)構(gòu)的差異, 揭示南極土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對PAHs暴露的動態(tài)響應(yīng)和菲降解過程中具有顯著性差異的物種, 為后續(xù)深入開發(fā)利用南極土壤功能微生物資源提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 南極土壤樣本采集

2019年1月從南極菲爾德斯半島采集土壤樣品, 包括企鵝島、生物灣、長城站、烏拉圭站、俄羅斯站和油庫等6個站位(圖1)。上述6個站位的分布遵循隨機和等量原則, 具有良好的代表性, 可較為客觀地反映菲爾德斯半島區(qū)域的微生物多樣性。采用無菌鏟取距離表層約2—5 cm深度的土壤樣本, 置于無菌密封塑料袋中低溫保存(楊曉等, 2016)。所有樣本在-20 °C條件下運輸至國內(nèi), 并立即轉(zhuǎn)移至-80 °C低溫冰箱中保存。

圖1 南極菲爾德斯半島6個站位的地理位置

注: QED表示企鵝島, SWW表示生物灣, CCZ表示長城站, WLG表示烏拉圭站, ELS表示俄羅斯站, YK表示油庫

1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(minimal salt medium, MSM): KH2PO40.4 g/L, K2HPO40.2 g/L, (NH4)2SO40.4 g/L, NaCl 0.1 g/L, MgSO40.1 g/L, MnSO4·H2O 0.01g/L, Fe2(SO4)3·H2O 0.01 g/L, Na2MoO4·H2O 0.01 g/L, pH 7.2 (Jiao, 2016)。

菲降解菌群富集轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基: 先將菲溶于二氯甲烷, 采用0.22 μm孔徑的一次性無菌耐有機溶劑濾膜對其過濾除菌, 然后添加到MSM培養(yǎng)基中, 振蕩使二氯甲烷充分揮發(fā)。該培養(yǎng)基中菲的終濃度為0.2 g/L。

1.3 菲降解菌群的富集、轉(zhuǎn)接與菌群樣品準(zhǔn)備

在100 mL菲降解菌群富集轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基中分別加入不同站位的南極土壤樣品約5 g, 在25 °C、150 r/min、避光的條件下?lián)u床培養(yǎng)約30d至對數(shù)生長后期, 此為富集培養(yǎng)物RT0。以未添加土壤樣品的培養(yǎng)基在相同的條件下進行培養(yǎng)作為陰性對照。將10 mL富集培養(yǎng)物RT0接種于新配制的100 mL菲降解菌群富集轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基中(接種量為10%), 在上述相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長后期, 如此轉(zhuǎn)接5次, 此為傳代培養(yǎng)物RT1—RT5。在每次轉(zhuǎn)接后, 從富集、傳代培養(yǎng)物RT0—RT5每個樣品中取約10 mL菌液, 在4 °C、10 000 r/min的條件下離心, 棄上清, 菌體于-80 °C保存。上述每個站位各設(shè)置4個平行樣。將富集傳代培養(yǎng)過程(RT0—RT5)劃分為兩個階段: 富集培養(yǎng)階段(RT0)和傳代培養(yǎng)階段(RT1—RT5), 以便研究菲降解菌群在富集傳代培養(yǎng)過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律。

1.4 細(xì)菌總DNA提取及16S rRNA基因高通量測序

按照E.Z.N.A. Bacterial DNA Kit操作說明提取1.3所述細(xì)菌樣品的總DNA。采用NanoDrop 2000 超微量紫外分光光度計檢測DNA的純度和濃度。

以富集傳代培養(yǎng)過程中細(xì)菌樣品的總DNA為模板, 分別采用通用引物341F (5′-ACTCCTACGGGA GGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWT CTAAT-3′)對細(xì)菌16S rRNA基因的V3—V4區(qū)目標(biāo)序列進行擴增(杜璨等, 2017)。PCR擴增條件如下: 94 °C預(yù)變性3 min; 94 °C變性30 s, 56 °C退火45 s, 72 °C延伸45 s, 循環(huán)30次; 72 °C延伸10 min。使用Agencourt AMPure XP磁珠對PCR擴增產(chǎn)物進行純化并溶于洗脫緩沖液, 添加標(biāo)簽序列, 完成建庫。使用Agilent 2100生物分析儀(美國安捷倫)對文庫的片段范圍及濃度進行檢測。檢測合格的文庫采用Illumina HiSeq 2500平臺(BGI, 中國深圳)進行測序。

原始數(shù)據(jù)過濾后用FLASH軟件包將雙末端測序得到的成對reads(讀序)組裝成一條序列。然后, 利用軟件USEARCH (v7.0.1090)將拼接好的Tags在97%相似度下進行聚類, 得到OTU的代表序列。注釋數(shù)據(jù)庫為Greengene, 方法分類器為RDP Classifier v.2.2 (置信度閾值=0.6), 最終得到注釋的OTU結(jié)果序列表。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用MOTHUR (v1.31.2)和QIIME (v1.8.0)對OTU數(shù)據(jù)進行Alpha和Beta多樣性分析。采用Microsoft Excel 2013對Alpha多樣性指數(shù)結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理, 應(yīng)用單因素方差分析法(One-Way ANOVA)對菌群代際Alpha多樣性指數(shù)進行差異顯著性分析。利用R (v3.1.1)軟件包對代際菲降解菌群進行偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)和菌群相似性分析(analysis of similarities, ANOSIM), 以判斷富集傳代培養(yǎng)過程中菌群結(jié)構(gòu)的差異顯著性。通過Galaxy在線分析平臺(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)對屬水平物種的相對豐度矩陣進行線性判別分析(linear discriminant analysis effect size, LEfSe), 從而篩選出菲降解菌群在富集傳代培養(yǎng)過程中具有顯著性差異的物種。

2 結(jié)果和討論

2.1 富集傳代培養(yǎng)過程中菲降解菌群的生長狀況

靜置觀察富集培養(yǎng)30 d后的RT0富集培養(yǎng)物, 陰性對照無任何濁度或顏色變化, 而南極各個站位的富集培養(yǎng)物均有明顯的濁度和顏色變化。從富集階段進入傳代階段后, 陰性對照RT1仍無任何生長現(xiàn)象, 培養(yǎng)基中的底物菲亦無明顯降解, 菌液在600 nm波長處的吸光值(OD600)為0.05—0.10。當(dāng)菲降解菌群RT1培養(yǎng)至對數(shù)生長后期, 各個站位的培養(yǎng)物濁度明顯增加, 細(xì)胞密度增大, 其OD600為0.60—0.90。此外, 與無任何顏色變化的陰性對照RT1相比, 對數(shù)生長后期的菲降解菌群RT1培養(yǎng)物變?yōu)辄S色, 這是由菲代謝中間產(chǎn)物在280 nm波長附近的光吸收造成的(Kweon, 2014)。在隨后的傳代培養(yǎng)物中均出現(xiàn)了與上述培養(yǎng)物類似的細(xì)菌生長和底物降解現(xiàn)象, 表明菲的添加為菲降解菌提供了碳源, 促進了菲降解菌的生長增殖。

2.2 富集傳代培養(yǎng)過程中菲降解菌群的Alpha多樣性

根據(jù)物種豐富度(Observed species, Ace和Chao1)、物種多樣性(Simpson和Shannon)和物種覆蓋度(Good-coverage)對富集傳代培養(yǎng)過程中菲降解菌群的Alpha多樣性及其代際差異顯著性進行分析(表1,表2)。Good-coverage指數(shù)結(jié)果顯示各代菲降解菌群的覆蓋度均接近100 %, 說明測序數(shù)據(jù)足以真實反映菲爾德斯半島菲降解菌群的多樣性。從Observed species、ACE和Chao1等三項指數(shù)結(jié)果判斷, RT0物種豐富度較高, RT1—RT5的物種豐富度較低。南極各站位的富集培養(yǎng)階段培養(yǎng)物RT0在Observed species指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)上均顯著高于傳代培養(yǎng)階段的第一代培養(yǎng)物RT1 (<0.05), 但傳代培養(yǎng)階段相鄰兩代之間(RT1 vs RT2、RT2 vs RT3、RT3 vs RT4和RT4 vs RT5)微生物群落的物種豐富度無顯著性差異(>0.05)。富集傳代培養(yǎng)過程中物種豐富度顯著下降可能有兩方面的原因: 首先, 實驗室培養(yǎng)條件不利于部分種群的存活; 其次, 以菲為唯一碳源和能源對南極土壤微生物進行富集培養(yǎng), 對菌群產(chǎn)生選擇壓力, 不能利用菲的微生物在該選擇壓力下被淘汰。而在傳代培養(yǎng)階段, 菲降解菌群已適應(yīng)了該選擇壓力, 其物種豐富度變化相對較小。

表1 南極菲降解菌群在富集傳代培養(yǎng)過程中的Alpha多樣性指數(shù)

Tab.1 The alpha diversity indices of the phenanthrene-degrading bacterial consortia from Antarctica in enrichment culture and subcultures

注: RT0表示富集培養(yǎng)物, RT1表示第1次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT2表示第2次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT3表示第3次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT4表示第4次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT5表示第5次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, Observed species表示觀察到的物種數(shù), Ace和Chao1表示物種總數(shù), Simpson和Shannon表示物種多樣性, Good-coverage表示物種覆蓋度。

表2 南極代際菲降解菌群Alpha多樣性指數(shù)的單因素方差分析

Tab.2 One-way ANOVA analysis of the Alpha diversity indices between two consecutive subcultures of phenanthrene-degrading bacterial consortia from Antarctica

注:表示概率, RT0表示富集培養(yǎng)物, RT1表示第1次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT2表示第2次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT3表示第3次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT4表示第4次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT5表示第5次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物。

從Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)結(jié)果判斷, 富集傳代培養(yǎng)過程中RT0—RT5的物種多樣性無顯著差異(>0.05)。豐富度和均勻度是物種多樣性的重要組成部分, 且一般情況下物種豐富度越低, 其均勻度越高(Gosselin, 2006)。在富集傳代培養(yǎng)過程中, 物種豐富度雖有所下降, 但其均勻度升高, 致使物種多樣性變化不大。在相同的選擇壓力和培養(yǎng)條件下, 各存活物種的數(shù)目和生存權(quán)重之和越來越接近, 這可能是導(dǎo)致物種均勻度升高的原因。此外, 原始土壤微生物多樣性較高, 被淘汰微生物的生態(tài)位易于被群落內(nèi)其他微生物替代, 以維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定與平衡(嚴(yán)彬, 2014)。

2.3 富集傳代培養(yǎng)過程中菲降解菌群的Beta多樣性

采用PLS-DA分析了富集傳代培養(yǎng)過程中菲降解菌的群落結(jié)構(gòu)差異。如圖2所示, 圖中兩點之間的距離表示相應(yīng)樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。RT0各個站位的菲降解菌群形成較為獨立的一簇, 而RT1—RT5各個站位的菲降解菌群則相互重疊, 表明富集培養(yǎng)階段RT0的群落結(jié)構(gòu)與傳代培養(yǎng)RT1—RT5各個階段的群落結(jié)構(gòu)差異較大, 而傳代培養(yǎng)階段代際群落結(jié)構(gòu)差異較小。代際菲降解菌群的ANOSIM結(jié)果(表3)進一步表明RT0和RT1的群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異(<0.01), 而在傳代培養(yǎng)階段的相鄰兩代之間(RT1 vs RT2、RT2 vs RT3、RT3 vs RT4和RT4 vs RT5)的群落結(jié)構(gòu)無顯著差異(>0.05)。綜上, 富集培養(yǎng)階段RT0的微生物群落結(jié)構(gòu)經(jīng)歷了一次顯著變化后, 在傳代培養(yǎng)階段RT1—RT5趨于相對穩(wěn)定。Jiao等(2016)的研究發(fā)現(xiàn), 有機污染物作為降解基質(zhì)和環(huán)境因子能夠影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能, 觸發(fā)微生物群落的定向演替。且不同的污染物對微生物群落演替的方向有不同的影響, 形成不同的微生物群落結(jié)構(gòu)特征。本研究中富集培養(yǎng)階段的群落結(jié)構(gòu)與傳代培養(yǎng)各個階段的群落結(jié)構(gòu)有顯著差異, 主要是來源于菲作為唯一碳源和選擇壓力的驅(qū)動, 而這種在生長支持底物和生態(tài)位方面的選擇可能與微生物的生物化學(xué)進化(biochemical evolution)有關(guān)(De Gannes, 2013)。Dini-Andreote等(2014)的研究結(jié)果表明富集培養(yǎng)階段微生物群落的高復(fù)雜性可能是由初始土壤內(nèi)在的高豐度和隨機性微生物輸入引起的。此外, Jiao等(2016)發(fā)現(xiàn)烴類物質(zhì)越難降解, 微生物間的協(xié)同作用越強, 且微生物群落的合作強度隨著脅迫的增加而增加。因此, 在持續(xù)選擇壓力菲的作用下, 傳代培養(yǎng)階段微生物群落不斷演化并適應(yīng)該選擇壓力, 且參與菲降解的成員之間相關(guān)性不斷加強, 逐漸形成了相對穩(wěn)定的菲降解菌群。

圖2 富集傳代培養(yǎng)過程中南極菲降解菌群的差異

注: RT0表示富集培養(yǎng)物, RT1表示第1次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT2表示第2次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT3表示第3次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT4表示第4次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT5表示第5次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物。

2.4 富集傳代培養(yǎng)過程中菲降解菌群的物種組成及動態(tài)變化

OTU數(shù)據(jù)顯示某些微生物在各個富集培養(yǎng)物RT0中的豐度較高, 但在傳代培養(yǎng)物RT1中的豐度卻降為0。例如地桿菌屬()、類芽孢桿菌屬()、羅河桿菌屬()、溶桿菌屬()、棲熱菌屬()、豐收神菌屬()和纖維單胞菌屬()等。這些細(xì)菌可能不適應(yīng)實驗室培養(yǎng)條件或以菲為唯一碳源和能源的選擇壓力, 或不能利用菲作為生長底物, 因此在富集傳代培養(yǎng)過程中被逐漸淘汰。

表3 南極代際菲降解菌群的相似性分析

Tab.3 Analysis of similarities(ANOSIM) of bacterial community structure between two consecutive subcultures of phenanthrene-degrading bacterial consortia from Antarctica

注:表示概率, RT0表示富集培養(yǎng)物, RT1表示第1次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT2表示第2次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT3表示第3次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT4表示第4次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT5表示第5次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物。

從屬水平來看, 假單胞菌屬() (5.3%—29.4%)、鞘氨醇菌屬() (6.9%—34.4%)和貪噬菌屬()(1.4%—6.2%)在傳代培養(yǎng)過程中始終為菌群中的優(yōu)勢種(圖3)。其中,和為常見的PAHs降解菌(Singleton, 2011; 申國蘭等, 2018), 沈方圓等(2016)的研究進一步表明它們均通過中間裂解途徑對PAHs進行生物降解。基因組中具有PAHs降解途徑中的關(guān)鍵酶芳香環(huán)羥化雙加氧酶(aromatic cyclohydroxylated dioxygenase, ARHD) (De Sousa, 2017), 參與了PAHs的催化降解。因此, 在菲作為唯一碳源和能源的選擇性壓力下, 富集培養(yǎng)物RT0中的菲降解菌和參與菲降解的微生物成為菌群中的優(yōu)勢種, 并且保持了物種豐度的動態(tài)平衡。

、新鞘氨醇菌屬()、枝動菌屬()、噬氫菌屬()和節(jié)桿菌屬()在菲降解過程中起到重要作用, 可能為菲的降解提供初始動力(Pinyakong, 2003; Muangchinda, 2015)。譬如, 孟建宇等(2017)對的萘降解特性進行了研究, 發(fā)現(xiàn)該菌在適宜的條件下培養(yǎng)48 h后進入穩(wěn)定期, 60 h時萘降解率已高達(dá)91.43%。上述物種均為菲降解的先鋒物種, 但隨著傳代培養(yǎng)其豐度有所下降。、、金黃桿菌屬()、黃桿菌屬()、和紅育菌屬()等促進了菲的降解或參與了菲降解過程(黃星云等, 2017; Chen, 2019; Geng, 2019), 致使它們的豐度隨著傳代培養(yǎng)而升高。然而, 沉積物桿狀菌屬()的相對豐度增加可能是因為利用了菲的降解中間產(chǎn)物作為生長基質(zhì), 因為該菌并不具有降解菲的能力(Singleton, 2016)。上述微生物互養(yǎng)(cross-feeding)現(xiàn)象在有機污染物降解菌群中是一種普遍存在的物種互作機制。例如,可以分泌生物表面活性劑, 提高PAHs的生物利用度, 為其他細(xì)菌降解PAHs提供條件(Desai, 1997)。最后, 產(chǎn)堿桿菌屬()和甲基嬌養(yǎng)桿菌屬()等混合營養(yǎng)型細(xì)菌也具有潛在的PAHs降解能力。譬如,可以作為雙功能菌用于PAHs和亞砷酸鹽共污染系統(tǒng)的生物修復(fù)(Tang, 2013)。也曾被報道具有纖維素降解和PAHs共代謝的功能(Guo, 2020)。綜上, 添加菲作為唯一碳源和能源可以顯著改變富集培養(yǎng)過程中微生物群落的組成, 且不同的微生物在菲降解過程中通過復(fù)雜的微生物互作共同促進了菲的降解, 形成了相對穩(wěn)定的功能菌群(Guo, 2020)。

圖3 富集傳代培養(yǎng)過程中菲降解菌群在屬水平上的物種組成和相對豐度

注: RT0表示富集培養(yǎng)物, RT1表示第1次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT2表示第2次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT3表示第3次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT4表示第4次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT5表示第5次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物。

2.5 富集傳代培養(yǎng)過程中具有顯著性差異的物種

通過Lefse分析確定了富集傳代培養(yǎng)過程中具有顯著性差異的物種(LDA值>4) (圖4)。在屬水平上, 富集培養(yǎng)階段RT0中具有顯著性差異的物種為、、細(xì)小棒狀菌屬()和。在傳代培養(yǎng)階段, RT1中具有顯著性差異的物種為。RT4中具有顯著性差異的物種為。RT5中具有顯著性差異的物種為和。以菲為唯一碳源和能源的持續(xù)性選擇壓力和物種的生態(tài)位差異可能是上述物種成為代際間具有顯著性差異物種的原因。據(jù)文獻報道, 一些顯著性差異物種(譬如、和)不但在原位環(huán)境中是優(yōu)勢種(Lopatina, 2013; Geng, 2019; 李桂秀等, 2020), 而且具有降解菲的能力(Singleton, 2011; De Sousa, 2017; Guo, 2020)。綜上, 菲降解菌群中具有顯著性差異的物種在菲降解菌群中可能占據(jù)重要的生態(tài)位, 并可能是南極土壤環(huán)境中菲降解的主要驅(qū)動者, 對維持群落的動態(tài)平衡具有重要的作用。

圖4 南極菲降解菌群在富集傳代培養(yǎng)過程中具有顯著性差異的物種

注: RT0表示富集培養(yǎng)物, RT1表示第1次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT4表示第4次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT5表示第5次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, RT2和RT3無具有顯著性差異的物種, 不在圖中顯示

3 結(jié)論

本研究以菲為唯一碳源和能源對南極土壤微生物進行富集和連續(xù)傳代培養(yǎng), 并利用高通量測序技術(shù)對微生物群落結(jié)構(gòu)進行分析, 揭示了富集傳代培養(yǎng)過程中南極菲降解菌的動態(tài)變化規(guī)律。研究表明南極土壤微生物群落響應(yīng)了菲的暴露和選擇性壓力, 富集培養(yǎng)階段與傳代培養(yǎng)階段的群落結(jié)構(gòu)具有顯著性差異, 但傳代培養(yǎng)階段代際群落結(jié)構(gòu)間無顯著性差異。大量微生物因不能適應(yīng)實驗室培養(yǎng)條件或不能利用菲而在傳代培養(yǎng)階段被淘汰。、、、和等適應(yīng)了該選擇壓力并在傳代培養(yǎng)階段形成了動態(tài)平衡的優(yōu)勢物種群體。它們在富集傳代培養(yǎng)中可能通過復(fù)雜的物種互作促進菲的降解利用。此外,、、等代際間具有顯著性差異的物種不僅是南極土壤環(huán)境中菲降解的主要驅(qū)動者, 還在維持群落的動態(tài)平衡中發(fā)揮著重要的作用。該研究為后續(xù)深入開發(fā)利用南極土壤功能微生物資源提供了參考依據(jù)。

致謝 本研究得到中國南極第35次科考隊以及南極長城極地生態(tài)國家野外觀測研究站的支持，特此致謝。

申國蘭, 李 利, 陳 莎, 2018. 微生物降解石油源多環(huán)芳香烴的研究進展. 土壤, 5(1): 16—27

嚴(yán) 彬, 2014. 效用管理研究. 北京: 北京郵電大學(xué)出版社

杜 璨, 許晨陽, 王 強等, 2017. 秦嶺紅樺林土壤細(xì)菌群落剖面分布特征及其影響因素. 環(huán)境科學(xué), 38(7): 3010—3019

李桂秀, 宋易洋, 趙 芯等, 2020. 基于高通量測序?qū)δ蠘O菲爾德斯半島土壤微生物多樣性的初步研究. 漁業(yè)研究, 42(3): 195—204

楊 曉, 丁 慧, 臧家業(yè)等, 2016. 南極菲爾德斯半島土壤可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性分析. 極地研究, 28(1): 34—41

沈方圓, 孫明明, 焦加國等, 2016. 四環(huán)素對芘污染農(nóng)田土壤微生物修復(fù)的影響及響應(yīng)過程. 土壤, 48(5): 954—963

孟建宇, 李 蘅, 唐 凱等, 2017. 兩株氫噬胞菌的萘降解特性分析. 化工環(huán)保, 37(3): 300—303

黃星云, 張澤宇, 熊蘇雅等, 2017. 菲反硝化降解菌群的富集及其群落結(jié)構(gòu)解析. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 37(11): 4314—4321

曾獻春, 鄭李娟, 葛風(fēng)偉等, 2016. 新疆石油污染土壤苯并(a)芘降解微生物多樣性研究. 生態(tài)科學(xué), 35(4): 79—85

Bargagli R, 2008. Environmental contamination in Antarctic ecosystems. Science of the Total Environment, 400(1—3): 212—226, doi: 10.1016/j.scitotenv.2008.06.062

Campbell I B, Claridge G G C, Balks M R, 2004. The effect of human activities on moisture content of soils and underlying permafrost from the McMurdo Sound region, Antarctica. Antarctic Science, 6(3): 307—314, doi: 10.1017/S0954102094000477

Chen C M, Ming J, Yoza B A, 2019. Characterization of aerobic granular sludge used for the treatment of petroleum wastewater. Bioresource Technology, 271: 353—359, doi: 10.1016/j.biortech.2018.09.132

Chong C W, Dunn M J, Convey P, 2009. Environmental influences on bacterial diversity of soils on Signy Island, maritime Antarctic. Polar Biology, 32(11): 1571—1582, doi: 10.1007/s00300-009-0656-8

De Gannes V, Eudoxie G, Hickey W J, 2013. Prokaryotic successions and diversity in composts as revealed by 454-pyrosequencing. Bioresource Technology, 133: 573—580, doi: 10.1016/j.biortech.2013.01.138

De Sousa S T P, Cabral L, Júnior G V L, 2017. Diversity of aromatic hydroxylating dioxygenase genes in mangrove microbiome and their biogeographic patterns across global sites. MicrobiologyOpen, 6(4): e00490, doi: 10.1002/mbo3. 490

Desai J D, Banat I M, 1997. Microbial production of surfactants and their commercial potential. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 61(1): 47—64, doi: 10.1128/.61.1.47-64. 1997

Dini-Andreote F, De Cássia Pereira e Silva M, Triadó-Margarit X, 2014. Dynamics of bacterial community succession in a salt marsh chronosequence: evidences for temporal niche partitioning. The ISME Journal, 8(10): 1989—2001, doi: 10.1038/ismej.2014.54

Geng Y C, Zhang Y M, Qin K, 2019. Sphingomonas paeninsulae sp. nov., isolated from soil sampled at Fildes Peninsula, Antarctica. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 69(12): 3702—3709, doi: 10.1099/ijsem.0.003504

Gosselin F, 2006. An assessment of the dependence of evenness indices on species richness. Journal of Theoretical Biology, 242(3): 591—597, doi: 10.1016/j.jtbi.2006.04.017

Gouin T, Mackay D, Jones K C, 2004. Evidence for the “grasshopper” effect and fractionation during long-range atmospheric transport of organic contaminants. Environmental Pollution, 128(1—2): 139—148, doi: 10.1016/j.envpol.2003. 08.025

Guo Y T, Rene E R, Wang J J, 2020. Biodegradation of polyaromatic hydrocarbons and the influence of environmental factors during the co-composting of sewage sludge and green forest waste. Bioresource Technology, 297: 122434, doi: 10.1016/j.biortech.2019.122434

Jiao S, Chen W M, Wang E T, 2016. Microbial succession in response to pollutants in batch-enrichment culture. Scientific Reports, 6(1): 21 791, doi: 10.1038/srep21791

Kweon O, Kim S J, Kim D W, 2014. Pleiotropic and epistatic behavior of a ring-hydroxylating oxygenase system in the polycyclic aromatic hydrocarbon metabolic network fromPYR-1. Journal of Bacteriology, 196(19): 3503—3515, doi: 10.1128/JB.01945-14

Lee L S, Hagwall M, Delfino J J, 1992. Partitioning of polycyclic aromatic hydrocarbons from diesel fuel into water. Environmental Science & Technology, 26(11): 2104—2110, doi: 10.1021/es00035a005

Levin S A, 2013. Encyclopedia of Biodiversity. 2nd ed. San Diego: Elsevier Science & Technology

Lopatina A, Krylenkov V, Severinov K, 2013. Activity and bacterial diversity of snow around Russian Antarctic stations. Research in Microbiology, 164(9): 949—958, doi: 10.1016/j.resmic.2013.08.005

Ma Y F, Wang L, Shao Z Z, 2006. Pseudomonas, the dominant polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria isolated from Antarctic soils and the role of large plasmids in horizontal gene transfer. Environmental Microbiology, 8(3): 455—465, doi: 10.1111/j.1462-2920.2005.00911.x

Muangchinda C, Chavanich S, Viyakarn V, 2015. Abundance and diversity of functional genes involved in the degradation of aromatic hydrocarbons in Antarctic soils and sediments around Syowa Station. Environmental Science and Pollution Research, 22(6): 4725—4735, doi: 10.1007/ s11356-014-3721-y

Phillips D H, 1983. Fifty years of benzo(a)pyrene. Nature, 303(5917): 468—472, doi: 10.1038/303468a0

Pinyakong O, Habe H, Omori T, 2003. The unique aromatic catabolic genes in sphingomonads degrading Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs). Journal of General and Applied Microbiology, 49(1): 1—19, doi: 10.2323/jgam.49.1

Singleton D R, Adrion A C, Aitken M D, 2016. Surfactant-induced bacterial community changes correlated with increased polycyclic aromatic hydrocarbon degradation in contaminated soil. Applied Microbiology and Biotechnology, 100(23): 10165—10177, doi: 10.1007/ s00253-016-7867-z

Singleton D R, Richardson S D, Aitken M D, 2011. Pyrosequence analysis of bacterial communities in aerobic bioreactors treating polycyclic aromatic hydrocarbon-contaminated soil. Biodegradation, 22(6): 1061—1073, doi: 10.1007/s10532- 011-9463-3

Tang J Z, Feng T C, Cui C Z, 2013. Simultaneous biodegradation of phenanthrene and oxidation of arsenite by a dual-functional bacterial consortium. International Biodeterioration & Biodegradation, 82: 173—179, doi: 10. 1016/j.ibiod.2013.02.012

RESPONSES OF SOIL MICROORGANISMS TO PHENANTHRENE IN ENRICHMENT CULTURES AND SUBCULTURES FROM FILDES PENINSULA, ANTARCTICA

LI Shu-Jun1, 2, CUI Zhi-Song2, BAO Mu-Tai1, LUAN Xiao3, LI Ying-Chao2, ZHENG Li2

(1. Frontiers Science Center for Deep Ocean Multispheres and Earth System; Key Laboratory of Marine Chemistry Theory and Technology, Ministry of Education; College of Chemistry and Chemical Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China; 2. Marine Bioresources and Environment Research Center, First Institute of Oceanography, Ministry of Natural Resources of China, Qingdao 266061, China; 3. State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China)

To reveal the succession of the Antarctic polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)-consuming bacterial communities, phenanthrene was utilized as the sole source of carbon and energy to enrich and subculture PAHs-degrading bacteria from soil samples at six different geographical stations in Fildes Peninsula, Antarctica. The bacterial community structures and biodiversity of the phenanthrene-degrading bacteria in enrichment culture and subcultures were analyzed by high-throughput amplified sequencing. Results of alpha diversity showed that the enrichment culture exhibited significantly higher species richness than those of the subcultures (<0.05), and the species richness showed no significant difference among the subcultures (>0.05). More importantly, results of beta diversity showed that the structure of phenanthrene-degrading bacterial consortia exhibited significant difference between the enrichment culture and the subcultures (<0.05). A large number of microorganisms had high abundance in the enrichment culture stage, but they were eliminated in the subculture stage because they could not adapt to the laboratory culture conditions or could not use phenanthrene. In contrast, the structure of phenanthrene-degrading bacterial consortia exhibited no significant difference among different subcultures (>0.05). The genera,,,, andwere the main phenanthrene-degraders, and they were stabilized dynamically in subcultures. In addition,,, andplayed a major role in maintaining dynamic balance in phenanthrene-degrading bacterial consortia. This study improved the understanding of degradation potential of persistent organic pollutants and the dynamics of the key species in Antarctic soil, and provided new insights into the exploitation and utilization of Antarctic microbial resources, especially for environmental protection.

Antarctica; soil; phenanthrene; enrichment; subculture; microbial diversity

* 國家自然科學(xué)基金, 42076165號; 自然資源部業(yè)務(wù)化項目, JD0619008號; 中央高校基本科研業(yè)務(wù)費國家重大項目培育項目, 201822009號。李淑君, 碩士研究生, E-mail: lishujun1116@ stu.ouc.edu.cn

崔志松, 碩士生導(dǎo)師, 副研究員, E-mail: czs@fio.org.cn; 包木太, 博士生導(dǎo)師, 教授, E-mail: mtbao@ouc. edu.cn

2021-02-02,

2021-03-16

Q93

10.11693/hyhz20210200032