國產頭孢克肟膠囊在健康受試者體內的生物等效性研究

隋 鑫，李曉斌，王華偉，曹 瑩，喻 明，陳 璐，王文萍

頭孢克肟（cefixime）是第一個口服有效的第三代頭孢菌素類抗生素[1]，對革蘭陽性菌及革蘭陰性菌均有抗菌效果[2]。1999年已在80多個國家得到廣泛的臨床應用。頭孢克肟的制劑劑型有膠囊劑、顆粒劑、混懸劑、片劑（普通片劑、咀嚼片、分散片）等。頭孢克肟膠囊的原研公司為日本長生堂制藥株式會社，商品名為Cefspan?。石藥集團歐意藥業有限公司生產的頭孢克肟膠囊規格為0.1 g，批準文號為國藥準字H20041669，屬于國家基本藥物目錄。根據國務院規定，化學藥品新注冊分類實施前批準上市的仿制藥，凡未按照與原研藥品質量和療效一致原則審批的，均須開展一致性評價[3]。本研究采用液相色譜串聯質譜（HPLC-MS/MS）法測定給藥后不同時間點頭孢克肟血藥濃度，以評價頭孢克肟膠囊國產制劑與進口制劑在中國健康受試者的生物等效性及安全性，為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和研究對象

1.1.1 藥物與儀器 參比藥物：頭孢克肟膠囊（商品名Cefspan?），規格0.1 g/粒，批號BG011，含量102.2%，由日本長生堂制藥株式會社生產，由石藥集團歐意藥業有限公司提供。受試制劑：頭孢克肟膠囊（商品名歐健），0.1 g/粒，批號136170998，含量99.3%，由石藥集團歐意藥業有限公司生產和提供。

頭孢克肟對照品：HPLC純度99.0%，批號1250-023A1，TLC公司提供； [13C3，15N2]-頭孢克肟（頭孢克肟內標物）：HPLC純度 95.22%，核素純度 99%13C, 98.6%15N，批號ZZS17101801，IsoReag提供。

研究用儀器如下：AB Sciex API 4000 質譜儀；島津LC-20ADXR液相色譜系統；Thermo Fisher Heraeus Muitifuge X1R離心機；Sartorius CPA225D或MSA6.6S-OCE-DM分析天平；Merck Millipore Milli-Q純水儀；ABSciexAnalyst 1.6.3?數據采集軟件。

1.1.2 受試者的選擇 本研究由遼寧中醫藥大學附屬醫院國家藥物臨床試驗機構承擔，試驗方案經遼寧中醫藥大學附屬醫院藥物臨床試驗倫理委員會批準。受試者簽署知情同意書。按照受試者隨機號將健康受試者按照1∶1比例隨機分配到 2個給藥程序（受試制劑T-參比制劑R或參比制劑R-受試制劑T）之一。

入選標準：18周歲及以上的健康受試者；體重指數在19.0～26.0 kg/m2，男性受試者體重≥50.0 kg，女性受試者體重≥45.0 kg。無心、肝、腎、消化道、內分泌、血液系統、呼吸系統、神經系統以及精神異常，代謝異常等病史。

排除標準：有煙酒嗜好者；有頭孢菌素類、青霉素類抗生素過敏史、其他藥物或食物過敏史、過敏體質者；生命體征、體格檢查、心電圖及各項實驗室檢查結果異常且經臨床醫師判斷有臨床意義；酒精呼氣檢查、尿液藥物篩查呈陽性者；乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒抗原（抗體）陽性者，HIV陽性者；給藥前28 d內服用了任何改變肝酶活性的藥物；給藥前14 d內服用了任何處方藥、非處方藥、草藥等。

空腹組入組32名健康受試者：其中T-R組有男12名、女4名，平均年齡為（25.3 ± 8.0）歲（19.1～47.8歲），平 均 身 高 為（170.5 ± 8.0）cm（157.5～189.5 cm），平均體重為（62.0 ± 9.1）kg（49.3～86.2 kg），平均體重指數為（21.3 ± 2.1）kg/m2（19.0～25.0 kg/m2）；R-T組有9名男性受試者、7名女性受試者，平均年齡為（25.7 ± 6.5）歲（19.6～39.6歲），平均身高為（167.0 ± 8.2）cm（157.0～182.0 cm），平均體重為（64.1 ± 9.1）kg（48.6～81.4 kg） ，平 均 體 重 指 數 為（23.0 ± 2.2）kg/m2（19.0～26.0 kg/m2）。餐 后 組 入 組26名健康受試者：其中T-R組有11名男性受試者、2名女性受試者，平均年齡為（25.3 ± 4.5）歲（21.3～35.0歲），平均身高為（172.2 ± 6.3）cm（158.5～182.0 cm），平均體重為（64.5 ± 5.8）kg（56.6～74.5 kg），平 均 體 重 指 數 為（21.7 ± 1.3）kg/m2（19.5～23.9 kg/m2）；R-T組 有8名 男性受試者、5名女性受試者，平均年齡為（28.7 ± 10.6）歲（19.4～56.5歲），平均身高為（166.9 ± 10.3）cm（148.5～185.0 cm），平均體重為（62.4 ± 8.7）kg（45.1～75.0 kg），平均體重指數為（22.3 ± 1.6） kg/m2（19.8～24.8 kg/m2）。

1.2 給藥方案和血樣采集及處理

1.2.1 給藥方案 本試驗采用單中心、空腹/餐后、隨機、開放、兩周期、兩交叉試驗設計?？崭菇M和餐后組分別入組32名和26名受試者，隨機分為2組，分別口服頭孢克肟膠囊受試制劑和參比制劑0.1 g（1粒），用藥間隔7 d?？崭乖囼灲M受試者每周期給藥當天，在空腹10 h后以240 mL常溫水送服相應藥物；餐后試驗組受試者每周期給藥當天給藥前30 min開始進食高脂餐，并在30 min內進餐完畢，在開始進餐后30 min時準時以240 mL常溫水送服相應制劑。

1.2.2 血樣采集及處理 每周期給藥0時（給藥前60 min內）和給藥后0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、4.5 h、5 h、5.5 h、6 h、6.5 h、7 h、8 h、9 h、10 h、12 h、16 h、24 h采集靜脈血。每個時間點采集靜脈血約4 mL，至預冷的EDTA-K2抗凝管中，將采血管上下輕柔顛倒數次至血樣混勻，置于冰浴中暫放，血樣采集后60 min內在預冷離心機2～8 ℃條件下，2000 ×g，離心10 min，所有離心后血漿樣品在冰浴上被分為兩份，其中取約 1 mL 血漿加入到待測管中，其余血漿放入到備份管中。血樣采集2 h內將血漿樣品放入超低溫冰箱（≤－60℃）凍存。

1.2.3 色譜-質譜條件和血漿樣品預處理

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱：Ultimate XB-C18（2.1 mm×50 mm，3 μm）；流動相：A為含0.05% 乙酸和5.00 mmol/L NH4Ac的水溶液，B為100%甲醇；流速：0.400 mL/min；柱溫：40 °C；梯度洗脫 （0 min，15% B；0.3 min，15% B；0.5 min，50% B；1.8 min，50% B；1.9 min，95% B；3 min，95% B；3.1 min，15% B；4.5 min，15% B）；進樣量：10 μL。

1.2.3.2 質譜條件 離子源：Turbo Spray（ABSciex生產），ESI，正離子模式；掃描方式為MRM；頭孢克肟和內標[13C3，15N2]-頭孢克肟去集束電壓（DP）分別為68V和70V，碰撞能量（CE）分別為22V和21V；頭孢克肟用于定量分析的離子對為m/z454.0→m/z285.2，內標離子對為m/z459.0→m/z290.1。

1.2.3.3 血漿樣本預處理 待測生物樣品室溫融化后，轉移至冰浴條件下存放，向96孔板中加入50.0 μL樣品（待測生物樣品、標準曲線樣品、質控樣品）；對于雙空白樣品和零點樣品，加入50.0 μL空白人血漿。除雙空白樣品和不含內標的定量上限樣品外，向所有樣品中加入50.0 μL內標工作溶液（1 000 μg/L）；對于雙空白樣品和不含內標的定量上限樣品中，加 50.0 μL 50%甲醇水溶液。將96孔板充分振搖1 min。向所有樣品中加入200 μL甲醇。將96孔板密封后，充分振搖10 min。將所有樣品在4 ℃條件下以4 000 r/min轉速離心10 min。將50.0 μL上清液轉移到干凈的96孔板中，以200 μL超純水稀釋。將96孔板密封后，充分振搖10 min，放置于自動進樣器中，10.0 μL進樣分析。

1.2.4 統計學處理 用Phoenix WinNonlin（8.0版）軟件以非房室模型計算各受試者體內頭孢克肟的藥動學參數。并對AUC0-t、AUC0-∞和Cmax經自然對數轉換后進行方差分析（ANOVA），然后采用雙單側t檢驗、計算90%CI統計分析方法來評價受試制劑與參比制劑的生物等效性。當受試制劑與參比制劑的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞幾何均值比的90%CI在80.00%～125.00%區間內，則認為兩制劑生物等效。

2 結果

2.1 受試者入組及完成情況

空腹組隨機33名受試者，有1名于第一周期給藥前出現不良事件，退出試驗；有2名受試者在第二周期給藥前退出試驗，未參加第二周期試驗，30名受試者均按方案要求完成試驗；餐后組入組26名健康受試者，均按方案要求完成試驗。

2.2 方法學評價

2.2.1 專屬性 頭孢克肟與其內標的保留時間均約為1.24 min，色譜峰峰形良好。血漿中內源性物質不干擾樣品的測定。

2.2.2 標準曲線與定量下限 以待測物（頭孢克肟）與內標 [13C3，15N2] -頭孢克肟的色譜峰面積的比值為縱坐標，以血漿中待測物的質量濃度（x）與峰面積比（y）進行線性回歸，頭孢克肟血漿標準曲線的質量濃度為20、40、150、500、1 500、2 500、3 200 μg/L，所得頭孢克肟回歸方程為y=0.001 313x+0.0 003 263（r2=0.998 1）。結果表明頭孢克肟血藥濃度在20～3 200 μg/L范圍內線性關系好，其定量下限為20 μg/L。

2.2.3 精密度與準確度 制備定量下限濃度水平和低、中、高3個濃度水平的質控樣品（頭孢克肟的質量濃度為20、50、800、2 400 μg/L），每濃度取6樣本分析，連續測定3 d，根據當日的標準曲線計算QC樣品的實測質量濃度，結果表明低、中、高3個濃度水平的質控樣品檢測結果的批內和批間精密度均≤4.2%，定量下限濃度水平的質控樣品檢測結果的批內和批間精密度均小于≤6.4%。除定量下限濃度水平外的質控樣品的批內檢測準確度偏差為－3.3%～3.6%，定量下限濃度水平的質控樣品的批內檢測準確度偏差為8.5%～10.0%，除定量下限濃度水平外的質控樣品的批間檢測準確度偏差為－1.7%～1.0%，定量下限濃度水平的質控樣品的批間檢測準確度偏差為9.5%。表明各質量濃度質控樣品的批內、批間精密度和準確度良好。

2.2.4 提取回收率和基質效應 低、中、高3個質量濃度的提取回收率分別為91.6%、91.1%、93.9%，內標[13C3，15N2]-頭孢克肟的提取回收率為92.7%，血樣中頭孢克肟和內標提取回收率均較高和穩定。6個不同來源的單個基質中，頭孢克肟低、中、高濃度水平下，內標歸一化的基質因子均值為97.1%～101.2%，精密度≤2.5%；3個濃度水平內標歸一化的基質因子總平均值為99.1%，精密度為2.1%，符合基質效應考察的要求。

表1 頭孢克肟在血漿中的精密度和準確度Table 1 Accuracy and precision of cefixime concentration in plasma

2.2.5 穩定性 頭孢克肟血漿樣品室溫/冰浴下放置15.5 h、－20 ℃/－70 ℃條件下5次凍融循環、 －20 ℃條件下長期冰凍7 d 1 h、－70℃條件下長期冰凍26 d、69 d；血漿樣品處理后的上清液在 8 ℃自動進樣器中（處理后樣品穩定性）放置4 d 4 h、血漿樣品處理后的上清液稀釋液在8 ℃自動進樣器中（進樣重現性）放置4 d 3 h和7 d 9 h，以上條件下穩定性均良好。

2.3 平均血藥濃度-時間曲線

空腹和餐后試驗中受試者服藥后頭孢克肟血藥濃度-時間曲線見圖1和圖2。

圖1 空腹組受試者服用受試制劑(T)與參比制劑(R)后血漿中頭孢克肟平均血藥濃度-時間曲線Figure 1 Mean plasma concentration-time curve of test (T) and reference (R) cefixime after single dose of cefixime capsule under fasted condition

圖2 餐后組受試者服用受試制劑(T)與參比制劑(R)后血漿中頭孢克肟平均血藥濃度-時間曲線Figure 2 Mean plasma concentration - time curve of test (T) and reference (R) cefixime after single dose of cefixime capsule under fed condition

2.4 藥動學參數

空腹試驗有30名健康受試者口服受試制劑和32名健康受試者口服參比制劑，有2名受試者在第二周期入住日退出試驗，而未進入藥動學分析集（PKS）。餐后試驗組26名受試者全部納入藥動學參數集分析。受試者空腹和餐后單次口服受試制劑和參比制劑后血漿中頭孢克肟的藥動學參數見表2。

表2 空腹和餐后試驗頭孢克肟主要藥動學參數Table 2 The main pharmacokinetic parameters of cefixime under fasted and fed conditions

2.5 生物等效性評價

表3中數據結果表明，經雙單側t檢驗分析后，Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的幾何均數比值（受試制劑/參比制劑）的90%CI結果均在可接受等效范圍（80.00%～125.00%）內，P值均＜0.05，即本試驗兩制劑在空腹給藥條件下和餐后給藥條件下均具有生物等效性。

表3 頭孢克肟膠囊生物等效性結果Table 3 Bioequivalence of test cefixime capsules compared to reference cefixime capsules

2.6 安全性評價

空腹試驗過程中30名受試者服用受試制劑，有4名受試者發生5例次不良事件，其中1名受試者發生2次不良反應，分別為血白細胞計數降低1次和血中性粒細胞計數降低1次，有1名受試者失訪。32名受試者服用參比制劑，有7名受試者發生10例次不良事件，其中2名受試者發生4例次不良反應，分別為白細胞計數降低2例次和中性粒細胞計數降低2例次，有2名受試者失訪。除1名受試者的1次不良事件嚴重程度為中度，其余不良事件均為輕度。2名受試者因不良事件退出。

餐后試驗所有26名受試者用藥后均完成安全性觀察，受試制劑有6名受試者發生8例次不良事件，其中3名受試者發生5例次不良反應，分別為白細胞計數降低3次和中性粒細胞計數降低2次，有1名受試者失訪。參比制劑有3名受試者發生4例次不良事件，其中2名受試者發生3例次不良反應，分別為丙氨酸轉氨酶升高1次、白細胞計數降低1次和中性粒細胞計數降低1次，有2名受試者失訪。受試者的不良事件的嚴重程度均為輕度。兩組均無嚴重不良事件發生。試驗期間發生的不良事件已按照該方案的要求及標準操作規程進行了申報和處理。表明受試制劑和參比制劑的安全性和耐受性良好。

3 討論

本分析方法采用穩定核素標記的[13C3，15N2]-頭孢克肟作為內標，[13C3，15N2]-頭孢克肟與待測物頭孢克肟有相同的理化性質，兩者保留行為和離子化行為一致，可以避免基質效應、回收率等導致檢測結果不可靠的情況出現。HPLC-MS/MS具有靈敏度高、選擇性好的優勢特點。本試驗結果顯示，空腹試驗頭孢克肟受試制劑與參比制劑的達峰時間分別為（4.45±0.65）h和（4.64±0.86）h，與文獻報道基本一致[4-5]；餐后試驗頭孢克肟受試制劑與參比制劑的達峰時間分別為（5.33±1.13）h和（5.75 ±1.01）h，結合本試驗獲得藥動學參數，提示進食高脂餐可能會導致頭孢克肟達峰時間延遲、吸收減少。

本研究受試制劑和參比制劑的各藥動學參數均非常接近，兩種制劑的藥動學特點相似，Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的 幾 何 均 值 比 值 的90%CI皆 在80.00%～125.00%，表明本試驗受試制劑與參比制劑生物等效。安全性數據表明，中國健康受試者單次空腹和餐后服用0.1 g頭孢克肟膠囊安全性良好。綜上所述，中國健康志愿者空腹和餐后狀態下口服0.1 g頭孢克肟膠囊受試制劑與參比制劑具有生物等效性，受試制劑與參比制劑安全性和耐受性均良好。