叢枝菌根育苗緩解西瓜枯萎病的機制*

李淑君，王兵爽，王 媛，張舒桓，張夕雯，張曉暉，徐國華，任麗軒

（南京農業大學資源與環境科學學院/農業部長江中下游植物營養與肥料重點實驗室/江蘇省有機固體廢棄物資源化協同創新中心，南京210095）

西瓜是世界廣泛栽培的水果，我國西瓜種植面積和產量分別占世界的52.7%和67.0%[1]。江蘇省種植面積在2016年達到19.28萬hm2，為經營者帶來了極大的經濟效益[2]。近年來，西瓜種植面積不斷擴大，受耕地面積減少的限制，常出現重茬栽培，容易受連作障礙影響，加重作物的病蟲害。西瓜連作病害主要是尖孢鐮刀菌西瓜專化型造成的枯萎病[3]，西瓜枯萎病嚴重時造成西瓜大量減產[4]。生物防治是可持續農業防控枯萎病的重要方法[5]，利用具有拮抗作用的微生物來減少甚至遏制病原菌的數量，以降低枯萎病的發病率。叢枝菌根真菌（AMF）是生態環境中分布廣泛的一種有益內生真菌，能與80%以上的陸生植物建立共生關系[6]，增強植物抗旱性[7]，促進磷素吸收，有效緩解由連作障礙引起的病蟲害，提高宿主植物的抗病性。

西瓜連作枯萎病的發生與西瓜植株抗病性和根際病原菌數量密切相關[8]。在連作土壤中，西瓜形成叢枝菌根后，無論是嫁接苗還是自根苗，均能顯著提高根系中幾丁質酶、β-1,3-葡聚糖酶、苯丙氨酸解氨酶（phenylanlanine ammonia-lyase，PAL）、過氧化氫酶（catalase，CAT）以及過氧化物酶（peroxidase，POD）的活性，提高對逆境的反應能力[9]。

田間直接接種叢枝菌根菌對抑制西瓜枯萎病有一定的效果，其作用機制是改善了西瓜氮、磷、硼、鋅等礦質營養，提高抗病性[10]，主要是促進了西瓜對土壤中礦質態磷素的吸收[11]。由于土壤中的磷營養和微生物環境復雜，田間直接接種叢枝菌根菌對菌根定殖存在風險，本研究設想在西瓜育苗期間接種叢枝菌根菌，形成叢枝菌根苗，研究叢枝菌根苗在移栽后生理功能的發揮及其機制。叢枝菌根育苗的方法在樹木和其他作物上已經成功應用[12-13]。作者所在研究組已經證實叢枝菌根育苗能提高西瓜根系防御性酶活性[14]，本研究將進一步證實這些防御性酶在轉錄水平上是否有表達量的變化。此外，根外菌絲分泌的酸性磷酸酶在提高根際土壤酸性磷酸酶活性、促進有機磷水解、提高根際有效磷含量也起著重要作用[15]。叢枝菌根化培育的西瓜苗在移栽后是否能繼續保持或提高西瓜根際土壤酸性磷酸酶活性，以提高根系水解和利用土壤中有機磷的能力，從而提高西瓜抗病能力，尚未可知。本研究將采用叢枝菌根育苗的方法，探討西瓜根系在苗床形成叢枝菌根，移栽后是否在轉錄水平上提高西瓜防御性酶編碼基因表達量，提高西瓜抗病能力；而且在大田中是否可以保持侵染率，并從提高根際有機磷利用能力方面提高抗病能力。

1 材料與方法

1.1 供試材料

西瓜品種為早佳-8424（Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum and Nakaicv. Zaojia-8424）。

根內根孢囊霉（Rhizophagus intraradices，R.i）菌種由北京市農林科學院植物營養與資源研究所提供，采用土壤和河沙基質，種植玉米和三葉草擴繁，產生孢子、菌絲體、土壤和河沙的混合接種劑。

西瓜專化型尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumf.sp.niveum，FON）由本實驗室從發病西瓜植株上篩選并保存[16]。病原菌FON為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）活化的西瓜專化型尖孢鐮刀菌，接入馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基（potato dextrose broth，PDB）溶液，在 28℃220 r·min-1條件下振蕩培養7 d，用血球計數板計數，尖孢鐮刀菌孢子數為107CFU·mL-1。用尖孢鐮刀菌選擇性培養基[17]篩選菌株。

西瓜育苗基質為作物秸稈、稻殼、木屑、菇渣等有機固體廢棄物的混合物，發酵后混合蛭石和珍珠巖無機物料。基質由淮安柴米河農業科技發展有限公司惠贈。

1.2 試驗設計

1.2.1 土培盆栽試驗 盆栽試驗設置在南京農業大學資源與環境科學學院溫室。共設置4個處理：（1）-AMF-FON：非叢枝菌根育苗，不接種FON（對照）；（2）+AMF-FON：叢枝菌根育苗，不接種FON；（3）-AMF+FON：非叢枝菌根育苗，接種FON；（4）+AMF+FON：叢枝菌根育苗，接種FON。重復3次。土壤采自南京農業大學牌樓試驗基地，經γ-射線輻照滅菌。土壤基本理化性狀為：堿解氮55.8 mg·kg-1，有效磷4.2 mg·kg-1，速效鉀132 mg·kg-1，pH 7.8。試驗中西瓜苗在50孔的育苗盤培育，用西瓜專用育苗基質，叢枝菌根化育苗的處理在育苗盤中接種叢枝菌根菌菌種，非菌根苗接種等量的滅菌叢枝菌根菌菌種和菌種濾液。育苗20 d時，移栽至裝有無菌低磷土的盆缽中，每盆移栽5株。移栽后采用灌根法接種FON孢子懸浮液，分別在移栽后第5天、第10天、第15天接種FON，每株澆灌5 mL。移栽20天后，處理3（-AMF+FON）的西瓜苗出現枯萎病癥狀，收獲。收獲時，小心將西瓜植株完整取出，抖去與根系分離的土壤，收集根際土壤待測枯萎病病原菌數量，取植株洗凈，待測生物量、酶活性、基因表達量。

盆缽中土壤施肥量為：N（Ca（NO3）2·4H2O）1.68 g·kg-1，P（KH2PO4）0.68 g·kg-1，K（K2SO4）0.24 g·kg-1，Mg（MgSO4·7H2O）0.51 g·kg-1，Fe（FeSO4·7H2O）0.025 g·kg-1，Zn（ZnSO4·7H2O）0.022 g·kg-1。

1.2.2 大田試驗 大田試驗研究叢枝菌根育苗對西瓜根系利用有機磷及抗枯萎病的影響。試驗設置在江蘇省句容市（119°17′E，31°95′N），土壤基本理化性狀為堿解氮72.68 mg·kg-1，有效磷14.09 mg·kg-1，速效鉀55 mg·kg-1，pH 4.24。試驗設置兩個處理：非叢枝菌根育苗（-AMF）和叢枝菌根育苗（+AMF）。每個處理4個重復。將接種物以每缽5 000接種勢單位分別置于營養缽內，對照則加入等量的滅菌接種物，并與缽中土壤混勻后播種。待西瓜幼苗長至兩片真葉時移栽入大田，小區面積120 m2，每666.7 m2定植 650株，試驗期間除草、灌水等管理正常，西瓜成熟時收獲。收獲時，按照五點法采集西瓜、土壤樣品，每小區采集5個植株樣品，采集時將西瓜根系從土壤中挖出，用抖土法收集西瓜根際土壤待測，將每株西瓜所有果實稱重計產。

1.3 樣品采集與測定

1.3.1 植株生物量及磷吸收量 盆栽試驗收獲后，采集植株地上部和地下部的鮮樣，105℃殺青，70℃烘至恒重，測定干物質量。稱取烘干樣0.100 0 g，采用硫酸-過氧化氫消煮，取消煮液采用鉬銻抗比色法測定全磷含量[12]，計算磷吸收量。

1.3.2 抗性相關基因表達量 從葫蘆科基因組網站（http://cucurbitgenomics.org）查得西瓜基因組抗性相關酶幾丁質酶、β-1,3-葡聚糖酶和PAL酶基因序列，并設計引物（表1）[18]。RNA提取和cDNA合成及實時熒光定量（RT-qPCR）分析參照文獻[19]。

表1 PCR擴增引物Table 1 Primers used for PCR amplification

1.3.3 西瓜根系酶活性 分別用幾丁質酶、β-1，3-葡聚糖酶、苯丙氨酸解氨酶試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）進行測定。

1.3.4 土壤酸性磷酸酶活性 采用磷酸苯二鈉法測定[12]，于660 nm波長處比色。

1.3.5 土壤有效磷含量 采用鉬銻抗比色法測定[12]。

1.3.6 菌根侵染率 采用曲利苯藍染色法[14]。菌根侵染率/%=Σ（0%×根段數+10%×根段數+20%×根段數+···+100%×根段數）/總根段數。

1.3.7 枯萎病調查方法及枯萎病分級標準 0級：健康植株，無發病癥狀；1級：葉片或莖蔓由下而上萎蔫，萎蔫面積占全株的1/4或1/4以下； 2級：葉片或莖蔓由下而上萎蔫，萎蔫面積占全株的1/4～1/2，莖蔓上有琥珀色膠狀物；3級：葉片或莖蔓由下而上萎蔫，萎蔫面積占全株的1/2以上，莖蔓上有琥珀色膠狀物；節間變短，下部病莖表面產生白色或粉紅色霉層，阻礙發育；4級：整株枯萎死亡。

病情指數/%=Σ（級數×該級數發病株數）/（總調查數×最高級數）×100

發病率/%=發病株數/總調查數×100

防治效果/%=（對照的病情指數-接種AM真菌的病情指數）/對照的病情指數×100

1.3.8 土壤中西瓜枯萎病病原菌數量和AM真菌孢子數 用選擇培養基稀釋分離法測定土壤中枯萎病病原菌數量[19]。采用濕篩傾注-蔗糖離心法，體視鏡（OLYMPUS MVX10，南京奧利科學儀器有限公司，南京）下計數AM真菌孢子數[18]。

1.4 數據處理

用Microsoft Excel 2013對數據進行統計與圖表處理，采用SPSS 17.0單因素方差分析（One-way ANOVA）的圖基（Tukey）方法進行不同處理的差異顯著性檢驗，顯著性水平為P≤0.05。

2 結 果

2.1 叢枝菌根育苗對西瓜枯萎病發病率的影響

表2 表明叢枝菌根育苗可有效抑制西瓜枯萎病。在接種FON處理下，與非叢枝菌根育苗處理相比，叢枝菌根育苗的西瓜植株發病率降低了22.22%，病情指數降低了23.15%，防治效果達到36.23%。接種FON的西瓜根際土壤中發現了大量的尖孢鐮刀菌，叢枝菌根育苗顯著降低西瓜根際土壤病原菌數量。

表2 叢枝菌根育苗對西瓜枯萎病的影響Table 2 Effects of inoculation of arbuscular mycorrhizae at the seedling stage on Fusarium wilt of watermelon

2.2 叢枝菌根育苗對西瓜植株生物量積累和菌根侵染率的影響

如圖1所示，接種FON處理時，叢枝菌根育苗的西瓜地下部干物質量顯著高于非叢枝菌根育苗處理，表3表明西瓜根際接種FON對西瓜根系菌根侵染率無影響。

表3 西瓜根系菌根侵染率Table 3 Arbuscular mycorrhizal colonization rate of watermelon root

2.3 叢枝菌根育苗對西瓜基因表達量的影響

ClPR4、ClPR5和ClPR6是西瓜中編碼幾丁質酶基因，如圖2a所示，與對照處理相比，叢枝菌根苗接種FON時，顯著提高西瓜根系和葉片ClPR4表達量；圖2b所示，叢枝菌根苗接種FON時，西瓜根系ClPR5表達量顯著提高，為非叢枝菌根苗不接種FON處理的2倍；叢枝菌根育苗同時接種FON處理時，西瓜根系和葉片ClPR5表達量較其他處理顯著提高。圖2c表明叢枝菌根育苗接種FON處理時，西瓜葉片ClPR6表達量顯著高于其他處理。

ClGlu1、ClGlu2和ClGlu3是西瓜中編碼β-1，3-葡聚糖酶的基因。圖3a表明接種FON處理時西瓜根系ClGlu1表達量顯著高于對照，叢枝菌根育苗接種FON處理時，西瓜根系ClGlu1表達量顯著高于對照，相對表達量提高了38倍；叢枝菌根育苗接種FON處理時，西瓜葉片ClGlu1表達量顯著高于其他處理。圖3c表明叢枝菌根育苗接種FON處理時，西瓜葉片ClGlu3表達量顯著高于其他處理，分別為叢枝菌根育苗不接種FON、單接種FON和對照處理的1.4倍、1.3倍、71倍；叢枝菌根育苗不接種FON或單接種FON時，西瓜根系ClGlu3表達量均顯著高于對照，且叢枝菌根育苗接種FON處理時，根系ClGlu3表達量顯著高于其他處理。

ClPAL4、ClPAL8和ClPAL11是西瓜中編碼苯丙氨酸解氨酶的基因。圖4a表明接種FON處理時，根系ClPAL4表達量顯著提高；叢枝菌根育苗接種FON處理時，西瓜根系及葉片ClPAL4表達量顯著高于其他處理。圖4b表明，叢枝菌根育苗接種FON處理時，西瓜葉片ClPAL8相對表達量較其他處理顯著提高。圖4c表明，叢枝菌根育苗接種FON處理時，西瓜根系ClPAL11表達量顯著高于其他處理。

2.4 叢枝菌根育苗對西瓜植株抗性相關酶活性的影響

如圖5a所示，與對照相比，接種AM菌提高了西瓜根系幾丁質酶活性。圖5b所示，在西瓜根際接種FON時，叢枝菌根育苗可提高西瓜葉片β-1，3葡聚糖酶活性，較非叢枝菌根育苗處理提高27.3%。圖5c所示，叢枝菌根育苗接種FON、叢枝菌根育苗不接種FON以及單接種FON處理時，西瓜葉片苯丙氨酸解氨酶活性均顯著高于對照處理，其中叢枝菌根育苗不接種FON處理時苯丙氨酸解氨酶活性為對照處理的1.3倍。

2.5 叢枝菌根育苗對西瓜根際土壤酸性磷酸酶活性的影響

如圖6所示，大田試驗表明，與非叢枝菌根育苗處理相比，叢枝菌根育苗顯著提高了西瓜根際土壤酸性磷酸酶活性，與非叢枝菌根育苗相比，提高了7.3%（圖6a），并顯著提高西瓜根際土壤有效磷含量。

2.6 叢枝菌根育苗對西瓜發病率的影響

如圖7所示，叢枝菌根育苗顯著提高西瓜根系菌根侵染狀況（圖7a、圖7b、圖7c），并且叢枝菌根育苗顯著提高根際土壤及非根際土壤孢子數（圖7d），改善西瓜根系環境，顯著降低了西瓜發病率（圖7e）。

2.7 叢枝菌根育苗對成熟期西瓜生物量及磷吸收量的影響

如表4所示，大田試驗表明，叢枝菌根育苗處理下，西瓜地上部干物質量顯著高于非叢枝菌根育苗處理；叢枝菌根育苗顯著降低西瓜根、莖、葉、瓜皮的磷吸收量；叢枝菌根育苗處顯著提高西瓜單瓜生物量。

3 討 論

植物形成叢枝菌根提高抗生物脅迫和非生物脅迫的能力。叢枝菌根植物提高抗逆能力的可能機制有：

3.1 提高植物抗性相關酶活性

幾丁質和葡聚糖是真菌細胞壁的主要成分，幾丁質酶和β-1，3葡聚糖酶通過降解菌絲細胞壁，破壞菌絲端部生長而使其頂端細胞壁變薄，導致病原體死亡而降低病害發生[20]。苯丙氨酸解氨酶催化L-苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸，進一步合成植保素、木質素和酚類等抗病性次生代謝物[21]。葉片是PAL酶活性高效表達的部位，PAL酶活性表達呈周期性變化，PAL酶活性與枯萎病抗性呈正相關[22]。本研究結果進一步證實，西瓜在苗期形成叢枝菌根，誘導表達的抗性相關酶基因，在移栽大田后表達量仍處于上調的水平，具有較高的抗枯萎病能力。主要有根系幾丁質酶編碼基因ClPR4、ClPR5上調（圖2a，圖2b），根系β-1，3葡聚糖酶編碼的ClGlu1基因上調（圖3a），以及編碼PAL酶的ClPAL4基因在西瓜葉片及根系中的表達量均上調（圖4a）。而且通過對菌根豌豆根系中病原菌Aphanomyces euteiches的肽酶活性和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的關系研究，證實了真菌提高植物的抗病性并不是減少了病原菌的生物量，而是抑制了病原菌酶的活性[23]。本研究進一步證實，培育叢枝菌根苗，西瓜移栽后能夠保持抗病性，顯著降低西瓜枯萎病發病率及病情指數（表2）。西瓜在發生枯萎病害時，組織內的相關抗病基因表達量提高，AM真菌的定殖也上調西瓜根系ClaPR4、ClaPR5、ClaGlu3和ClaPAL4的表達量，提高西瓜的抗病性。

3.2 促進植物礦質養分吸收，提高植物抗病性

AM真菌與植物根系共生可產生互惠互利的生態效應，其根外菌絲可增強對土壤養分和水分的吸收，尤其是有效提高了植物組織中的磷含量，提高植物抗逆性。植物磷營養的改善對植物的抗逆能力有顯著的提高效果[24-25]，叢枝菌根通過菌絲體促進根系對水分和土壤礦質養分的吸收[26]，提高植物抗逆能力。酸性磷酸酶催化有機磷水解，產生植物可吸收的無機磷。植物根系酸性磷酸酶基因表達量上調，提高根系分泌酸性磷酸酶活性，進而增強根際土壤酸性磷酸酶活性，從而提高植物利用有機磷的能力[27]。本研究進一步證實，叢枝菌根化育苗顯著提高根際土壤酸性磷酸酶活性（圖6a），水解根際有機磷，提高根際土壤中磷的有效性，也提高了根際土壤中有效磷含量（圖6b）。因此，培育叢枝菌根西瓜苗，在移栽后仍可有效提高西瓜根際土壤酸性磷酸酶活性，增強根系利用有機磷的能力，改善西瓜磷營養，從而提高西瓜抗枯萎病的能力。

3.3 其他可能機制

（1）抑制根際環境中的病原菌數量。番茄形成叢枝菌根，顯著降低根際土壤中番茄專化型尖孢鐮刀菌數量，有效防控番茄枯萎病[28]。（2）調控植物根際微生物區系結構。叢枝菌根育苗提高了西瓜根際土壤的孢子數（圖7e），改善了根際微生物環境。

4 結 論

西瓜在發生枯萎病害時，AM真菌的定殖通過上調西瓜根系ClPR4、ClPR5、ClGlu3和ClPAL4的表達量，提高抗病相關酶活性，從而提高西瓜的抗病性；叢枝菌根育苗能夠改善根際微生物環境，并通過提高根際土壤酸性磷酸酶活性促進難溶磷的水解，提高土壤有效磷含量，從而促進西瓜對養分的吸收，提高西瓜抗病能力，降低西瓜枯萎病發病指數，有效防控枯萎病。