基于微根管技術的鹽脅迫下小麥根系生長原位監測方法*

李燕麗，王昌昆，盧碧林，李繼福，潘賢章?

（1. 土壤與農業可持續發展國家重點實驗室（中國科學院南京土壤研究所），南京 210008；2. 長江大學農學院，湖北荊州 434025）

根系是作物吸收水分和養分的主要部位，其生長狀態和分布情況是反映作物生長發育的重要標志。土壤鹽分脅迫抑制作物根系組織生長和分化，引起作物生理干旱，影響作物養分吸收和產量的形成。研究發現，隨著土壤鹽含量的增加，作物根深、根長和根量呈顯著降低趨勢，嚴重阻礙其正常生長發育，甚至造成作物死亡[1-5]。因此，鹽脅迫下對作物根系生長和分布狀況進行動態監測，對作物生產管理具有重要意義[6]。

土壤是作物的主要生長基質，同時也給根系生長的觀測研究帶來諸多困難，為解決這一問題，研究者們提出了一系列根系觀測方法。目前，植物根系觀測主要采用土鉆法、挖掘法等破壞性觀測方法，以及微根管法、容器法等非破壞性觀測方法[7]。然而就觀測方法的精確性和便利性而言，微根管法被認為是根系生長發育動態監測的較好方法。而且隨著微根管技術的不斷改進，該方法逐漸成為獲取植物根系參數最合適的研究方法，它能夠實現單個根系或者某個根系片段生長發育變化趨勢的長期監測，以進行植物根系生長、死亡和分解等特征的詳細研究[8-10]。微根管法的優勢在于它能夠實現在多個時間段內原位、重復、無損觀測根系的生長發育。

利用微根管技術還能夠實現作物根系生長動態的可視化，且運用圖像處理分析技術易于獲取根系的量化信息。目前，微根管法已被廣泛應用于農作物[10-12]、草地[13-15]、森林[16-17]等根系研究中。國內外學者利用微根管技術對小根系的研究也已取得一定進展。Box 和Ramsuer[9]通過比較微根管法和土鉆法獲得的小麥細根參數發現，小麥根重密度與根長、根長密度均具有顯著正相關關系。Herrera 等[18]利用微根管技術監測氮和基因型對小麥根系生長的影響，發現氮是影響小麥根系生長和生存的主要因素。Rose 等[19]利用微根管技術觀測淺層地下鹽水灌溉小麥根系生長和分布狀況，發現根長密度隨土壤深度的增加而遞減，且與鹽水濃度呈顯著負相關關系。廖榮偉等[20]利用這一技術研究了華北平原小麥根系在土壤中的分布狀況，結果表明土壤水分影響小麥根系的生長，充足的土壤水分環境有利于根系的生長，使表層根系增多；輕度干旱有利于根系在中下層的生長延伸。因此，微根管技術的應用，為植物根系生長及其功能的研究提供了有效途徑。

國內外學者基于微根管技術對小麥根系的研究已開展了一定工作，但有關利用微根管技術觀測鹽脅迫下小麥根系生長的研究相對較少。我國土壤鹽漬化區域面積廣泛[21]，且小麥是鹽漬化區域重要的栽培作物。因此，本研究通過桶栽實驗，設計不同土壤鹽分處理，利用微根管技術對鹽脅迫下小麥根系的生長進行重復動態監測，以期為鹽漬化區域農作物生產的科學管理提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

本實驗采用桶栽方法，于2013—2014年在中國科學院南京土壤研究所進行。試驗點位于118°48′E，32°04′N，海拔12.03 m，屬北亞熱帶濕潤氣候，四季分明，雨水充沛，年均溫15.4℃，年降水量1 106 mm。供試土壤采自中國科學院南京分院東臺灘涂研究院試驗田。該土壤為潮鹽土亞類，母質為近代泥沙沉積物，屬粉砂質壤土，土壤呈弱堿性，養分含量較低，含鹽量為0.61 g·kg-1，已基本脫鹽（表1）。填裝土為經自然風干并過5目篩的土壤，實驗桶為直徑50 cm、高55 cm的塑料桶。

表1 供試土壤基本理化性質Table 1 Basic physic-chemical properties of the tested soil

本實驗共設6個鹽分梯度，土壤含鹽量分別為0.61（CK）、1.61（S1）、2.61（S2）、3.61（S3）、4.61（S4）以及5.61 g·kg-1（S5），分別屬于非鹽漬化土壤、輕鹽漬化土壤、中鹽漬化土壤、中鹽漬化土壤、重鹽漬化土壤和鹽土[22]。每個濃度水平4個重復（其中2個用于微根管觀測，2個用于破壞性取樣），共24個實驗桶。由于供試土壤已基本脫鹽，為獲取不同含鹽量水平的鹽漬土，按不同的鹽土比分別向供試土壤中加入相應質量的NaCl。土壤經充分混勻后裝入實驗桶內，按容重進行壓實（容重為1.2 g·cm-3），每桶干土質量約為70.0 kg。每桶加蒸餾水使土壤含水量達田間持水量的75%，以使各處理的最初土壤含水量保持一致，待其穩定3 d后進行播種。供試小麥品種為揚麥16，播種日期為2013年11月20日，每桶播種64株，播種方式為行播。采用常規施肥管理方法施肥，小麥生長期按約225 kg·hm-2的純氮施入土壤表層，其中基肥和追肥按6︰4比例分別于播種時（復合肥）和拔節期（尿素）施入。小麥生長期間除惡劣天氣外均在室外進行，如遇大風大雨天氣，則將其移至遮雨棚（圖1a）。根據其需要定量澆水，除草、除蟲等按常規高產管理要求進行。

1.2 微根管技術

本實驗采用微根管技術重復觀測小麥在不同生長期、不同土壤含鹽量下的根系長勢狀況。微根管技術是指在土壤中埋設透明玻璃管或塑料管，利用照相機通過管與土壤界面對根系生長狀況進行非破壞性觀察，其最大優點是在不顯著影響根系生長的前提下，實時監測植物根系生長的動態變化[9]。本實驗微根管的安裝方法是在每個鹽分梯度中隨機選取2個實驗桶安裝透明的75 cm長、6 cm粗的硬質聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）管，并使其位于2行小麥中間。每根管傾斜45°埋入土壤中，其中埋入70 cm，露出5 cm，且埋在土壤內的底端封死（圖1b）。為避免光照對根系生長的影響，將露出土壤的部分全部涂成黑色，管口用蓋子封住避光[23]。

本研究采用 “雙筒式植物根系原位觀測系統裝置”[23]，利用微型相機（Firefly MV，Point Grey，加拿大）進行根系圖像采集。觀測時將相機由USB連接線連接至電腦，通過圖像數據采集軟件FlyCap2（Point Grey，加拿大）顯示根系圖像，并在圖像采集前檢查圖像，以保證圖像質量。數據采集時每隔1 cm土層深度采樣一次，每次從0°到360°旋轉攝像頭，獲取18～20張根系圖片，圖片大小為1 328×1 048像素，以JPG格式存儲。

1.3 根系樣品采集

分別于2014年1月7日（分蘗期）、2014年2月21日（返青期）、2014年3月15日（拔節期）和2014年4月15日（孕穗期）采集樣品數據。在進行微根管觀測的同時，利用土鉆法采集小麥根系作為對照。在未埋設微根管的實驗桶內進行破壞性取樣，用直徑為6 cm土鉆分層采集土壤樣品（0～10、10～20、20～30、30～40和40～50 cm）。每次在桶內小麥行上和行間取兩個點，每層取兩個樣品，將相同鹽分梯度下同一土層深度的樣品混合為一個土壤樣品[20]。每次取樣后均填回等質量、等含鹽量的土壤。本實驗中所用實驗桶相對較大，因此，根系樣品采集時上一次取樣對下一次取樣造成的影響忽略不計。本試驗最后獲得的根系樣品個數為120個。將所采集的根系樣品進行清洗，獲得干凈的小麥根系。

1.4 根系參數獲取

對根系樣品中的粗根長度直接進行測量；細根先用電子天平稱量其總質量，再選出一部分測量其長度，計算其根質量/長度比例，并按該比例換算出細根總長度[20]。粗根和細根長度的總和為該樣品的根系長度。

根長密度是指單位土壤體積內的根長。基于土鉆法的根長密度計算公式為：

式中，ρL為根長密度，cm·cm-3；L1為10 cm厚的土壤體積中的總根長，cm；V為含有根系的土壤樣品體積，cm3。

對于微根管法，為了精確地從根系圖像中提取根系信息，本研究基于Matlab R2009b（Mathworks，Natick，MA，美國）和ArcGIS10.2（ESRI，Redlands，CA，美國）等圖像處理軟件，對根系圖像進行拼接、灰度圖轉化、增強對比度、二值化及中值濾波去除噪聲等預處理[20]。圖2顯示的是基于微根管技術觀測的返青期S2處理小麥根系在土壤中10 cm的原始圖像（a）、灰度圖（b）、二值化圖（c）及去噪聲后的圖像（d）。在根系圖像處理中，圖像拼接是將一組具有相互間重疊部分的圖像序列進行空間匹配、對準、重采樣合成后形成一幅包含各圖像序列信息的新圖像的技術，是根系圖像處理質量的關鍵。本研究進行根系圖像拼接主要包括以下步驟：1）圖像預處理：對圖像進行插值縮放，以消除圖像上的弧面誤差，其中弧面誤差計算為：單個平面像素對應的弧面像素大小=arcsin（單個CCD像素大小÷鏡頭至微根管外壁半徑）×π×鏡頭到微根管外壁半徑÷180。2）圖像對齊配準：先選取兩幅圖像的配準控制點，然后自動校正重疊部分的幾何差異，找出特征點，并按照特征點匹配法進行圖像配準。3）圖像融合：采用圖像融合功能將配準后圖像中的有用信息融合表達成一副圖像。由此可以看出，圖像間重疊度越高，特征點越多，拼接效果越好，但重疊度太高勢必會加大數據冗余量。因此，本研究在根系圖像采集過程中每隔1 cm獲取18～20張圖片，以使圖像橫向重疊和縱向重疊的重疊度分別在60%左右和15%～40%。

對處理好的根系圖像進行識別并分層計算小麥根長及根長密度。為更好地描述根系生長狀況以及與土鉆法獲得的數據進行比較，在利用微根管技術獲得根系參數時，常將面積單位轉換成體積單位[24]。根系長度的計算公式為：

式中，L2為基于微根管法計算的根系長度，cm；M為根系所占像素數；S為單個像素所占面積，cm2；N為根系平均直徑所占像素數；W為單個像素寬度，cm。其中，本實驗根系圖像中單個像素大小3.36 μm×3.36 μm。

根長密度的計算公式[25]為：

式中，A為微根管觀察的面積，cm2；DOF（depth of field）為微根管至周圍土壤的距離，cm。其中，DOF一般取值為0.2～0.3 cm[24]，本研究實際計算時取值為0.25 cm。

2 結 果

2.1 不同時期小麥根系圖像的直觀比較

圖3 為S5處理的12 cm深度土層某斷面的四個生長期小麥根系監測圖像。通過對比可以發現，隨著小麥的生長，根系數量持續增加，形態也有所變化。分蘗期和返青期，小麥根系呈透明色，根毛較多（圖3a、圖3b），說明根系生長旺盛，活力較強；從返青期至孕穗期，有些根系顏色開始變暗，活力減弱（圖3c），但新根系均有不同程度的增加（圖3d）。由此可見，基于微根管技術可直觀反映小麥根系的生長發育過程。

2.2 根長密度兩種方法的對比分析

對基于微根管法和土鉆法獲得的小麥根長密度進行對比分析（圖4）。由于小麥生長早期深部土層尚無根系分布，因此數據處理時忽略了根系參數為零的數據，最終用于對比分析的樣本數為98個。從圖4中可以看出，基于兩種方法獲得的根長密度值均勻分布在1︰1線兩側，相關系數r為0.91，呈極顯著正相關關系。按小麥生長時期分別進行對比分析發現，兩種方法結果之間均呈極顯著正相關關系，相關系數分別為0.87、0.88、0.93和0.94（圖5）。結果表明，在不同生長期，微根管法均可獲得很好的監測結果，且在拔節期和孕穗期監測效果最好。因此，微根管法能夠應用于小麥根系生長發育狀況的長期定點監測。

2.3 不同生長期小麥根長密度在土壤中的分布

本研究基于微根管法分別獲取了不同生長期小麥根長密度在0～10、10～20、20～30、30～40、40～50 cm土層中的分布狀況（圖6）。由圖6可見，所有處理下的小麥根長密度均在0～10 cm土層最大，且隨著土層深度的加深而遞減；同時，隨著小麥的生長，小麥根系深度逐漸向下推移。以CK為例，在分蘗期，小麥根系生長深度可達30 cm土層，而至小麥孕穗期，根系生長深度最大，可達50 cm土層。其他處理均有類似規律，這與前人結果[20]一致。

2.4 鹽脅迫對小麥根系的影響

由6種土壤鹽分處理下的根長密度分布圖可知（圖6），由于受到土壤鹽脅迫的影響，小麥根長密度分布基本上隨土壤含鹽量的增加而減小。在0～10 cm土層，S5的根長密度最小，在分蘗期、返青期、拔節期和孕穗期分別為0.62、0.64、0.89和0.99 cm·cm-3，明顯低于CK的小麥根長密度。此外，在同一生長期，不同鹽分處理下小麥根系生長深度不同。在返青期，S3、S4和S5的小麥根系深度達到30 cm，而其他鹽處理的根系深度達到40 cm（圖6b），S5的小麥根深直至孕穗期才達到40 cm（圖6d）。

為進一步比較不同鹽分處理下小麥根系長度，將小麥根系長度單位轉換成地表單位面積內的根系長度（km·m-2）。由圖7可以看出，非鹽漬化土壤下（CK）生長的小麥根系長度最大。在分蘗期，CK、S1和S2的小麥根長差異不明顯，但隨著小麥的生長，不同土壤鹽分處理下的小麥根系長度差異越來越明顯：在分蘗期，鹽土環境下（土壤含鹽量6.61 g·kg-1）的小麥根系長度（0.72 km·m-2）不足非鹽漬化土壤小麥根系長度（1.75 km·m-2）的1/2；至孕穗期差異最大，此時S5的根長達到最大（1.76 km·m-2），但也僅為CK根長（5.83 km·m-2）的1/3。

此外，不同鹽分處理下，從分蘗期至孕穗期根系增量差異較大，并隨著土壤鹽含量的增加，根系長度增量減少。且當土壤含鹽量超過3 g·kg-1時（S3、S4和S5），小麥根系增量明顯減少。其中，S5的根長增加最少，從分蘗期至孕穗期僅增加了1.03 km·m-2，而CK的根系長度增加最多，增量為4.08 km·m-2。

3 討 論

植物根系的生長發育是一個動態的過程。根長密度作為研究根系的一個基本參數，不僅反映了作物根系生長發育狀況，還反映了作物對土壤中水分和養分吸收利用情況，同時也是眾多根系吸收模型中的必要參數[26]。鹽脅迫下，小麥根系細胞質膜將最先受到傷害，導致細胞質膜選擇透性被破壞，細胞代謝失調，致使小麥正常的生長發育受到影響[27-28]。已有研究表明，土壤鹽分顯著抑制作物組織器官的生長、分化，加速其衰老，且其影響程度隨生長時期的不同而不同[29]。由不同生長時期的小麥根長密度分布（圖6）和根系長度變化（圖7）也可看出，S3、S4和S5的小麥根長密度和根系長度增長速度較慢，且從拔節期至孕穗期小麥根系長度增加較少，這與Rose等[19]的研究結果一致。此外，根據微根管法獲得的根系圖像發現，在小麥孕穗期，當土壤含鹽量超過3 g·kg-1時，小麥根系中銹根、死根增多（圖3d和圖8），且土壤含鹽量越高，這種現象越明顯；同時，在這一生育期不同鹽分處理下的根系長度差異也最大（圖7）。苗果園等[30]研究發現，在拔節期至孕穗期間，為冬小麥主根深扎的第二個盛期，同時伴隨側根的大量發生，可見在孕穗期，小麥根系生長受鹽分脅迫的累積影響最為嚴重。

本研究對比分析了不同生長期基于微根管法和土鉆法所獲得的小麥根長密度，兩種方法結果之間均呈極顯著正相關關系（圖4）。但是，當小麥根長密度較小時（接近0 cm·cm-3），基于兩種方法獲得的結果偏差相對較大，不能均勻分布在1︰1線兩側，且基于微根管法得到的根長密度基本均小于土鉆法得到的結果。這主要是由于當小麥根量較少時，在微根管壁上可能無或較少生長根系[24]，直接造成所獲得的根系圖像中根系信息較少，致使得到的根長密度一般會小于土鉆法獲得的結果。因此，利用微根管技術進行研究時，在保證微根管正確安裝的同時，可根據觀測時期、觀測深度來選擇合適的安裝角度和微根管數量，以提高其監測精度。

目前，中國有約占可耕地面積 20%的鹽堿地和鹽漬化土壤，鹽漬土分布廣、類型多，已成為影響中國農作物高產和增加經濟效益不可避免的困擾因素。小麥作為我國主要的糧食作物，是鹽漬化土壤區重要的栽培作物。因此，本研究利用微根管技術的原位、重復、無損、可視化觀測的特點，獲取鹽脅迫下小麥根系圖像，并進行鹽脅迫下不同生育期的小麥根系生長的直觀分析及其根系參數的估算，明確了鹽脅迫下小麥根長密度隨土壤深度的增加而遞減，隨土壤鹽含量的增加而減小的生長分布規律。研究結果與土鉆法所得結果一致，且兩種方法所得的根長密度具有顯著正相關關系，相關系數達到0.91（圖4），表明利用微根管技術可進行小麥根系生長發育的可視化動態監測，且方便可行，為土壤鹽漬化區域進行小麥根系的研究奠定了一定基礎。盡管與其他方法相比，微根管方法節省了大量人力物力，但大量根系圖片的后期分析方法仍有進一步改善的空間，尤其是鹽脅迫下小麥根系形態、根毛信息的提取[31-33]。因此，及時利用新技術、新方法對現有技術進行升級改造，提高數據分析效率和精度，推進微根管技術在區域尺度研究的應用，是今后微根管技術發展的主要目標。

4 結 論

基于微根管技術獲取小麥四個生育期的根系圖像，分析并研究了土壤鹽脅迫下根系生長及其分布狀況。結果表明：1）微根管法能夠準確地實現對鹽脅迫下小麥根系生長無損動態監測，并可獲取直觀可視的根系圖像和準確的數據信息，且在小麥拔節期和孕穗期效果較好。2）土壤鹽脅迫對小麥根系生長具有明顯的抑制作用，隨著土壤鹽含量的增加，小麥根系減少，根深變淺，且至孕穗期鹽脅迫程度最嚴重。當土壤中鹽含量超過3 g·kg-1時（S3、S4和S5），小麥根系生長速率明顯降低，至孕穗期，鹽土（S5）環境下的小麥根系長度（1.76 km·m-2）達到最大，但也僅為非鹽漬化土壤（CK）下（5.83 km·m-2）的 1/3。此外，通過根系圖像中根的顏色變化、根毛增減程度等信息，可直觀地判斷出根系活力及其功能狀況。將微根管技術應用于作物根系生長監測中，可充分發揮該技術原位、可重復、無干擾、可視化的優勢。本研究利用微根管技術有效解決了鹽脅迫下小麥根系生長監測困難的問題，為鹽漬化區域精準農業發展提供理論依據和技術支持。

致 謝 感謝中國土壤數據庫提供的數據支持。