多梳基因家族成員的Bmi-1與Ki67蛋白表在大腸腫瘤組織的表達情況及預后相關性

郭俊龍，梁 濱，田偉軍

(1.天津市寧河區醫院，天津301500；2.天津醫科大學總醫院，天津300052)

大腸腫瘤屬于臨床上常見的一種消化道腫瘤，隨著人們生活水平的提高和環境污染加劇，發病率逐年上升。在一些發達國家，大腸癌的發病率居第二位，而在我國，其發病率和死亡率分別為第三位和第四位，1991年首次從轉基因小鼠傳代淋巴瘤細胞中鑒定出Bmi-1基因是多梳基因家族成員(PcG)的一員[1-2]。Bmi-1屬于一種愿癌基因，在c-myc輔助下形成腫瘤。因此越來越多研究者開始關注Bmi-1和惡性腫瘤的發生與預后關系。但是關于Bmi-1基因和大腸腫瘤發生與發展的關系研究比較少見[3]。Ki67屬于細胞核上的一種非組蛋白，半衰期短，與細胞增殖有關。許多研究表明[4-5]，Ki67蛋白表達水平和細胞的增殖息息相關，并能夠反映出細胞的增殖程度。本文以Bmi-1和Ki67兩種蛋白的表達水平為例，應用免疫組化方式進行檢測，并探討兩者與大腸腫瘤和大腸癌中的表達意義，因此本文選取天津市寧河區醫院2017年2月到2019年2月共收治的100例大腸腫瘤患者作為研究對象進行研究，具體報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取天津市寧河區醫院2017年2月到2019年2月共收治的100例大腸腫瘤患者作為研究對象，所有患者通過病理檢查發現，100例大腸腫瘤患者中有60例為大腸癌，分，40例為大腸腺瘤患者，另取同期20例健康體檢患者的正常大腸黏膜組織，分為對照組。其中60例大腸癌患者的臨床資料完整，手術之前沒有進行過放療和化療，且隨訪3年以上。其中100例大腸腫瘤患者中男性55例，女性45例，年齡為18到85歲，平均年齡(63.41±1.64)歲；所有患者均符合大腸腫瘤診斷標準。20例健康體檢者之中，男性13例，女性7例；年齡為23-80歲，平均年齡(63.67±1.46)歲。兩組患者一般資料對比無明顯差異，可以進行對比。

1.2 方法

取標本進行連續切片，厚度為4 μm，并應用二甲苯進行脫蠟脫水處理之后，應用3%的過氧化氫溶液梯度乙醇進行處理，從而阻斷內源性過氧化物酶，并應用PBS緩沖液洗滌，然后用小鼠抗人Bmi-1單克隆抗體(1∶150稀釋，美國北部)冷卻組織加入和小鼠抗人Ki67單克隆抗體工作液(上海長島公司)分別加入，然后在孵育37℃水浴1小時，用PBS緩沖液沖洗，EnVisionTM添加二級抗體，然后在37℃水浴中孵育30分鐘，再次用PBS緩沖液洗滌，并用新制的DAB溶液顯影。用Mayer染料對細胞核稍作雙重染色，然后用梯度乙醇脫水，用中性香脂封閉，顯微鏡下觀察。并以實際染色切片作陽性對照，陰性對照應用PBS的條帶次級抗體阻斷切片。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 Bmi-1和Ki67蛋白在大腸腫瘤中的表達

Bmi-1陽性蛋白表現為細胞核內呈棕褐色或褐色顆粒，胞漿內少量呈褐色染色(見圖1)。大腸癌Bmi-1陽性表達數量為31例，表達率為51.7%，高表達15例，占比25.00%。40例大腸腫瘤患者中， 5.00%(2/40)高表達，20例正常對照組中0%的大腸黏膜有高表達。因此，大腸癌組織之中的Bmi-1蛋白高于大腸瘤組織(P<0.05)，而腺瘤組與正常對照組無顯著性差異(P>0.05)。Ki67在細胞核中的表達及其陽性表達以細胞核內存在褐色或棕色顆粒為標志,見圖1。Ki67高表達人數11例，占比18.30%； 40例大腸腺瘤中有1例高表達(嚴重不典型增生)，高表達率為2.50%(1/40)；20例對照組患者Ki67表達低于大腸瘤組和大腸癌組(P<0.05)，而腺瘤組與正常對照組之間的表達無顯著性差異(P>0.05)。

圖1 Bmi-l和Ki67蛋白在大腸腫瘤組織中的表達(SPX400)。(A) 正常大腸組織中Bmi-l的陰性表達；(B) Bmi-l在大腸腺瘤細胞核中弱表達(黃色)；(C)Bmi-l在結直腸腫瘤細胞核中的強表達(棕色)；(D)正常結直腸組織中Ki67的核染色陽性(棕黃色)；(E)結直腸癌中Ki67的核染色陽性(棕黃色)；(F) 大腸癌中Ki67的強核染色(棕色)。

2.2 60例大腸癌的臨床病理特點分析

Bmi-1蛋白表達與大腸癌轉移及TNM分期相關，即有遠處轉移者Bmi-1蛋白表達明顯高于無轉移者(P<0.01)。在TNM分期下，Ⅲ/Ⅳ期患者Bmi-1蛋白表達比Ⅰ/Ⅱ期患者高(P<0.05)，和患者的分化程度、腫瘤部位、大小、患者的年齡和性別無明顯關系，淋巴結轉移的組織學分類或發生率(P>0.05)，見表1。Ki67蛋白高表達與患者年齡、遠處轉移和TNM分期相關(P<0.05)。

表1 60例大腸癌的臨床病理特點分析(n)

2.3 Bmi-1表達影響因素的Logistic回歸分析

logistic回歸分析顯示只有遠處轉移與Bmi-1蛋白表達相關，也就說說遠處轉移屬于Bmi-1蛋白的高風險因素(P<0.05)，見表2。

表2 Bmi-1表達影響因素的Logistic回歸分析

2.4 Ki67表達影響因素的Logistic回歸分析

進一步的logistic回歸分析顯示，只有年齡與Ki67蛋白高表達相關，即年齡越小，Ki67表達越高(P<0.05，B=-1.921，OR=0.146)，見表3。

表3 Ki67表達影響因素的Logistic回歸分析

2.5 Bmi-1、Ki67蛋白表達與大腸癌預后相關性

Bmi-1蛋白高表達患者的生存率顯著低于低表達患者(P=0.015)，而Ki67蛋白高表達患者的生存率顯著低于低表達患者(P=0.000)，見圖2。

圖2 低或高表達Bmi-1或Ki67的結直腸癌患者的生存曲線

2.6 大腸癌組織中Bmi-1和Ki67蛋白表達的預測價值

Spearman相關分析顯示Bmi-1與Ki67蛋白表達有一定程度的正相關，但相關性較弱，無統計學意義(r=0.224，P=0.086)，見表4。

表4 大腸癌組織中Bmi-1和Ki67蛋白表達的預測價值

3 討論

腫瘤發生的多基因突變機制尚不清楚，人類Bmi-1基因在10號染色體斷臂13區，其中有10個內含子與10個外顯子。Bmi-1的基因編碼中有326個氨基酸核蛋白。Bmi-1蛋白的結構和果蠅蛋白結構類似，屬于中部DNA結構，N端環指結構，因為這兩個DNA區域和腫瘤形成具有相關性[6-7]。

當前已經有許多研究之中表明Bmi-1與腫瘤表達明顯相關。相關研究顯示[8]，51例大腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中Bmi-1基因的表達，發現Bmi-1mrna在大腸癌組織中的表達高于正常大腸主治的2到3倍。并且65%的患者Bmi-1蛋白呈中到強染色，其中p16INK4a和p14ARF的表達水平明顯下降，與大腸癌的發生發展有關。然而，我們的資料并未顯示與預后的關系。這一發現與最近其他研究所獲得的相似數據相一致，這些研究證實Bmi-1在人體內部會直接參與腫瘤發生、侵襲與轉移。相關研究顯示[9]，Bmi-1白丹水平與乳腺癌臨床分期呈正相關，也預測了Bmi-1可能屬于乳腺癌的一種新標志物。還有研究中顯示[10-11]，Bmi-1為陽性的大腸癌患者5年的生存率低于Bmi-1陰性患者。另外，Bmi-1mRNA陽性表達患者的生存率遠低于Bmi-1mRNA表達陰性患者，因此檢測Bmi-1mRNA有助于判斷腫瘤的發展和預后。本研究結果表明，Bmi-1在大腸癌組織中的陽性表達率為51.7%。在本研究中，Bmi-1在癌組織中的高表達率為25.0%，但是在常常組織與大腸腺瘤組織之中Bmi-1蛋白表達降低， 其中有2例大腸腺瘤患者Bmi-1蛋白高表達，1例健康者有嚴重的非典型增生，另1例有癌變。經統計學分析，Bmi-1蛋白在大腸癌、大腸腺瘤和正常大腸組織中的高表達有顯著性差異(P<0.05)。本研究還顯示，Bmi-1蛋白高表只與患者腫瘤TNM分期和遠處轉移有關。其中，有遠處轉移的結直腸癌患者Bmi-1蛋白表達明顯高于無遠處轉移的患者(P<0.01)，TNM分期III-IV患者Bmi-1蛋白表達明顯高于I-II期患者(P<0.05)。logistic回歸分析顯示只有遠處轉移與Bmi-1蛋白表達相關，也就說說遠處轉移屬于Bmi-1蛋白的高風險因素(P<0.05)，由此證明，Bmi-1在大腸癌組織中表達比較高也是判斷大腸癌轉移與侵襲的重要因素。而且本研究的生存區縣中也發現，Bmi-1蛋白高表達患者5年生存率低于低表達患者，因此可以應用Bmi-1蛋白作為大腸癌患者的預后判斷指標。

相關研究表明[13]，Ki67會參與細胞的增殖，也是對腫瘤惡性程度與侵襲能力判斷的重要指標。還有研究表明[14]，表明Ki67的表達與腫瘤部位、淋巴結轉移、Dukes分期和生存期有關。具體而言，Ki67在淋巴結轉移組中的表達比無淋巴結轉移組增加，并且隨著Dukes分期的推進而顯著增加。Ki67陽性表達高患者的生存率比陰性表達患者低，這也證明了Ki67陽性表達患者的預后較Ki67陰性患者差。因此，Ki67對預測結直腸癌預后有重要參考價值，屬于獨立預后指標的一種。本研究結果之中，Ki67在細胞核中的表達及其陽性表達以細胞核內存在褐色或棕色顆粒為標志。Ki67高表達人數11例，占比18.30%； 40例大腸腺瘤中有1例高表達(嚴重不典型增生)，高表達率為2.50%(1/40)；20例對照組患者Ki67表達低于大腸瘤組和大腸癌組(P<0.05)，而腺瘤組與正常對照組之間的表達無顯著性差異(P>0.05)，這說明，Ki67蛋白在大腸癌患者的表達之中增強，因此可以證明Ki67與大腸癌的發生與發展具有相關性。在進一步研究中發現，年輕患者的Ki67蛋白高于老年患者，并且其水平會隨著TNM的分期而逐漸增加。進一步回歸性分析顯示，年齡越小的患者，Ki67蛋白表達水平也就越高(P<0.05)，由此證明，大腸癌患者的年齡越小，腫瘤細胞的增殖越旺盛，而且惡性程度越高，預后越差。在生存分析中也顯示，Ki67蛋白高表達患者的生存率低于低表達患者，由此可以證明Ki67的高表達能夠判斷大腸癌的預后情況。

Spearman相關分析表明，大腸癌中Bmi-1蛋白表達與Ki67蛋白表達有一定的正相關，但無統計學意義(r=0.224，P=0.086)。其原因可能是本研究樣本數較少或Bmi-1蛋白參與調節Ki67蛋白表達，或Bmi-1蛋白對Ki67蛋白的間接調控。要解決這些問題還需要進一步的研究。

綜上所述，Bmi-1和Ki67蛋白的高表達與大腸癌的發生、轉移及預后密切相關。Bmi-1和Ki67可用于預測大腸癌的預后。Bmi-1可能間接調節CRC患者Ki67的表達。