miRNA-4497靶向PEA15對視網膜母細胞瘤細胞增殖及藥物敏感性研究

張丹，郭勇，岳以英，彭靜，胡俊喜

視網膜母細胞瘤（retinoblastoma,Rb）是一種兒童最常見的眼部惡性腫瘤，由視網膜未成熟細胞轉化發展而來[1]。全球每15,000～20,000 個兒童中就有1 例發病，每年新增約有9,000 例患兒[2]。目前針對雙眼Rb 的主要治療方法包括化學療法和局部療法[3]，但是因為診斷不及時及耐藥性等因素導致預后不理想。因此，闡明耐藥性機制并尋找新的治療靶標具有重要意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是小的非編碼RNA，長度約為19～25 個核苷酸，通過與靶標mRNA 的3' 端非編碼區（3'untranslated regions，3'-UTR）結合并誘導轉錄抑制或降解來調節基因表達，在多種癌癥中出現失調[4]。在喉鱗狀細胞癌中，miRNA-4497 可以通過負調控GBX2 起到抑癌作用[5]。然而miRNA-4497 在Rb 中的研究甚少，最近研究表明，miRNA-4497 在Rb 中高表達[6]，但其具體功能尚不明確。本研究將探討miRNA-4497 對Rb 細胞增殖及耐藥的影響，并探究其分子機制。

1 材料與方法

1.1 標本來源

本研究所用到的27 例Rb 患者腫瘤組織及瘤旁視網膜組織標本，收集于2017 年1 月—2019 年12 月新鄉醫學院第一附屬醫院、第四軍醫大學唐都醫院、天津市眼科醫院、西安市第四人民醫院4 家醫院眼科經病理確診為Rb 的患者。這項研究得到了醫院的機構審查倫理委員會的批準，并且所有參加者均在注冊后批準并簽署書面知情同意書。

1.2 材料與儀器

人Rb 細胞株Y79 購自美國模式培養物集存庫（ATCC）；RPMll640 培養基、胎牛血清均購自美國HyClone 公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega 公司；注射用奧沙利鉑購自齊魯制藥(海南) 有限公司；CCK8 試劑盒購自日本同仁公司；GAPDH、PEA15 抗體及山羊抗兔IgG 購自美國Cell Signaling Technology（CST）公司；Lipofectamine3000 購自美國Invitrogen 公司；過表達miRNA-4497 慢病毒購自上海吉凱基因科技有限公司；野生型PEA15 基因3'-UTR 實驗質粒、突變型3'-UTR 實驗質粒、miRNA-4497-模擬物及miRNA-4497-陰性對照物購自長沙博楚生物科技有限公司。實時熒光定量PCR (realtime quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)試劑盒購自廣州銳博生物有限公司。Infinite 吸光分度儀購自瑞士TECAN 公司。ViiATM7 Real-Time PCR System 購自美國ABI 公司。

1.3 細胞培養

Y79 細胞株使用含有10%胎牛血清的RPMll640 培基(其中含有1%的青霉素+鏈霉素)培養，培養條件為溫度設定為37℃，CO2濃度設置為5%。取對數生長期的細胞進行后續實驗。

1.4 細胞感染

將Y79 細胞株重懸于感染增強液中，保持密度為5×104個/mL，按照每孔體積為1 ml 接種到24 孔板中，按病毒感染復數（multiplicity of infection，MOI）=10，分別加入空載體病毒(陰性對照組)或miRNA-4497 過表達慢病毒(miRNA-4497 過表達組)混合液各3.5 μl，每孔均設置3 個復孔。培養8～16 h 后，更換培養基，繼續培養及傳代，使用嘌呤霉素篩選得到過表達及空載體病毒轉染的Y79 細胞株，用于后續研究。

1.5 RT-qPCR 檢測Y79 細胞株中miRNA-4497 和PEA15 的表達

采用RNA 抽提試劑盒提取病人組織標本總RNA，陰性對照組及過表達組Y79 細胞總RNA，按照說明書設置反應條件，先進行逆轉錄制備cDNA 文庫，后按照RT-qPCR 試劑盒說明書操作，所用引物序列如下（表1）。實驗結果采用2-△△Ct法進行統計分析。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.6 CCK8 檢測細胞增殖能力及對奧沙利鉑藥物敏感性

將感染后的細胞接種于96 孔板，密度為5×103個/孔，均設置3 個復孔，連續5 d 進行CCK8 檢測。將感染后的細胞接種于96 孔板，接種濃度為5×104個/孔，均設置3 個復孔，每孔分別加入配置好的奧沙利鉑溶液（濃度為0.125 μM、0.25 μM、0.5 μM、1 μM、2 μM），培養48 h 后進行CCK8 檢測。檢測前于每孔加入10 μl 的CCK-8 溶液，孵育3 h 后，吸光分度儀檢測每孔細胞在450 nm 處的吸光度值。

1.7 雙熒光素酶活性檢測

利用TargetScan 網站（http://www.targetscan.org）對miRNA-4497 進行靶基因預測，其靶基因可能為PEA15。按照Lipofectamine 3000 說明書對Y79 質粒進行共轉染，分為4 組：野生型+miRNA-4497 組、野生型+陰性對照組、突變型+miRNA-4497 組、突變型+陰性對照組，均設置3 個復孔，48 h 后，使用雙熒光素酶報告實驗試劑盒進行檢測，分析4 組細胞的螢火蟲熒光素酶活性及海腎熒光素酶活性。

1.8 Western blot 檢測PEA15 蛋白表達水平

將轉染后處于對數生長期的細胞收集，裂解后提取總蛋白，采用BCA 法進行細胞蛋白濃度定量。使用十二烷基硫酸鈉聚烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE）進行電泳反應，隨后進行轉膜反應，轉膜后使用快速封閉液封閉，加入一抗后，于4 ℃孵育過夜，于室溫孵育二抗1.5 h。進行曝光顯影。

1.9 統計學方法

采用GraphPad Prism 8 進行統計分析，所有實驗數據采用均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用LSD-t 檢驗。當P＜0.05時，則認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-4497 在Rb 組織中高表達

采用RT-qPCR 共檢測了27 例Rb 組織及27例癌旁視網膜組織標本，癌組織中的表達量（7.773±2.029）顯著高于癌旁視網膜組織（1.977±0.380），比較有統計學意義（t=14.590,P=0.000）（圖1A）。

2.2 RT-qPCR 檢測感染后miRNA-4497 表達

通過慢病毒感染并使用嘌呤霉素篩選，使用RT-qPCR 驗證，結果表明，相對于陰性對照組，過表達組細胞中miRNA-4497 表達增高，差異具有統計學意義（t=16.150,P=0.000），過表達組細胞構建成功（圖1B）。

圖1 miRNA-4497 基因表達情況。1A 轉染前，** 瘤組織與正常組相比，P＜0.01；1B感染后，*** 與陰性對照組相比，P=0.000

2.3 miRNA-4497 對Y79 細胞增殖的影響

CCK8 法驗證過表達miRNA-4497 后對Y79細胞增殖能力，相對于陰性對照組，過表達組細胞增殖速度從第3 d 開始明顯增高，2 組細胞增殖速度的差異具有統計學意義（t3d=6.500,t4d=7.691,均P=0.000）。

2.4 miRNA-4497 對Y79 細胞藥物敏感性的影響

采用CCK8 法檢測奧沙利鉑不同濃度下細胞的生長抑制率，在0.125 μM 時，2 組細胞生長抑制率的差異無統計學意義（P＞0.05），在濃度為0.25μM、0.5μM、1 μM、2 μM 時，過表達組細胞的生長抑制率比對照組低，且差異具有統計學意義(t0.25μM=4.277，t0.5μM=7.547,t1μM=8.302,t2μM=8.302；均P=0.000)（圖2B）。

圖2 CCK8 檢測Y79 細胞的增殖能力及奧沙利鉑的藥物敏感性。2A Y79 細胞的增殖能力；2B 奧沙利鉑對Y79 細胞的藥物敏感性。** 與陰性對照組相比，P＜0.01，*** 與陰性對照組相比，P=0.000

2.5 熒光素酶活性檢測結果

通過TargetScan 軟件預測miRNA-4497 的靶基因可能是PEA15，miRNA-4497 種子區存在與PEA15 基因3’非翻譯去互補配對序列，進而構建靶基因3’UTR 雙熒光素酶報告質粒與突變質粒，通過雙熒光素酶報告基因實驗進行驗證，野生型+miRNA-4497 組相對熒光素酶活性較陰性對照組顯著降低，有統計學意義（t=5.514，P=0.000）（圖3）。

圖3 miRNA-4497 通過靶向PEA15 3’UTR 抑制PEA1 的表達。*** 與陰性對照組相比，P=0.000

2.6 過表達miRNA-4497 抑制PEA15 的mRNA 及蛋白表達

RT-qPCR 結果顯示，相對于陰性對照組（0.910±0.023），過表達組（0.463±0.019）細胞mRNA 表達明顯降低，差異有統計學意義（t=77.856,P=0.000）；Western blot 結果顯示PEA15 蛋白水平明顯降低（圖4）。

圖4 Western blot 和RT-qPCR 檢測2組細胞中PEA15 的蛋白和mRNA 水平。4A PEA15 蛋白表達；4B PEA15 mRNA 表達量比較。*** 與陰性對照組相比，P=0.000

3 討論

視網膜母細胞瘤（Rb）是與RB1 雙等位基因缺失有關的視網膜惡性腫瘤，在血液和腫瘤樣本中的突變檢測率均為94.9%[7]。在過去的幾十年中，人們一直在努力尋找新的治療方法，但是目前仍面臨著巨大挑戰[8]。因此，闡明耐藥的潛在機制，尋求Rb 的潛在治療靶標至關重要。已有研究表明[9]，多種miRNA 的異常表達在Rb 的發病和進展中起著重要作用，miRNA-25-3p 通過抑制PTEN 促進Rb 細胞的惡性轉化。miRNA-31 和miRNA-200a 可影響Rb 細胞的增殖能力[10]。然而，miRNA-4497 在Rb 細胞中的研究甚少。本研究結果證實，miRNA-4497 在Rb組織中高表達，初步表明在Rb 中具有促腫瘤作用。細胞生物學實驗發現過表達miRNA-4497 可以顯著促進Y79 細胞的增殖能力，并且降低對化療藥物奧沙利鉑的藥物敏感性，促進腫瘤增長及耐藥。

miRNA-4497 于2010 年被發現[11]，后被報道其在感染不同類型結核分枝桿菌的THP-1 細胞中表達存在差異[12]。miRNA-4497 與滋養細胞凋亡和復發性流產相關[13]。近年來有其與腫瘤的相關報道[5，14-15]。在喉鱗狀細胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）中，miRNA-4497 通過直接靶向GBX2 發揮腫瘤抑制作用。此外，miRNA-4497 的過度表達可激活細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）[5]。與LSCC 不同，本研究表明Rb 細胞中，miRNA-4497 可能充當“癌基因”發揮促腫瘤作用。同時發現，miRNA-4497 直接針對PEA15 的3’UTR 抑 制 其mRNA 表 達，Western blot 及RTqPCR 實驗表明miRNA-4497 能夠下調Rb 細胞中PEA15 的蛋白及mRNA 表達。初步證實miRNA-4497 影響Rb 的進展及耐藥的機制是通過下調PEA15 發揮作用的。

PEA15 是一種小分子磷酸化蛋白，由130 個氨基酸殘基組成，含有NH2 末端死亡效應域和分布在細胞質中的COOH 末端不規則結構。它的DNA 序列位于1q21-22 號染色體上，在哺乳動物基因序列中高度保守[14]。PEA15 在人體組織中廣泛表達，并參與各種蛋白質之間的相互作用。它可以在體內通過發揮細胞因子的關鍵功能來調節細胞凋亡、增殖和葡萄糖代謝[15]。目前，已經發現PEA15 通過其死亡效應域（death effector domain,DED）和ERK1/2 靶向結合，抑制ERK1/2 磷酸化和核轉移，從而發揮抗凋亡作用[16]。近年來，研究發現PEA15 的表達與幾種類型的癌癥密切相關[17]。例如，發現PEA15 蛋白在食管癌中含量很高，PEA15 的高表達縮短了患者的平均生存時間[8]。一些研究表明，PEA15 在肝[18]、肺[19]、乳腺癌[20]和卵巢癌[21]等腫瘤中高表達。PEA15 的磷酸化使ERK 磷酸化并促進肝癌細胞的增殖和侵襲，通過抑制caspase-3/7 活性降低了索拉非尼的抗腫瘤作用[22]，而PEA15 的未磷酸化狀態抑制ERK 和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的磷酸化，從而抑制了乳腺癌和卵巢癌的增殖，侵襲和轉移及對雌激素耐藥性[20-21,23]。此外，抑制PEA15 可以導致細胞周期停滯在S 期并且增強順鉑化療敏感性[24]。本研究通過雙熒光素酶報告實驗證明，miRNA-4497 可與PEA15 基因3’非翻譯區互補配對。在人Rb 細胞株Y79 中過表達miRNA-4497，則PEA15 表達降低，表明miRNA-4497 可以抑制PEA15 基因的表達從而發揮抗腫瘤作用。

大多數化療藥物通過誘導循環腫瘤細胞DNA損傷及抑制細胞DNA 修復過程發揮作用[20]。參與這些活性蛋白的miRNA 同樣顯示出了抗腫瘤作用，部分已進入了臨床試驗，例如miRNA-16 模擬物用于間皮瘤及非小細胞肺癌的治療（NCT02369198）[25-26]。在本研究中，首次揭示了過表達miRNA-4497 通過直接靶向PEA15 來降低Rb 細胞的化療敏感性。因此，未來可通過開發miRNA-4497 抑制劑增強抗腫瘤能力，有可能轉化為Rb 化療的輔助治療藥物。

綜上所述，過表達miRNA-4497 可以明顯促進人Rb 細胞株Y79 的增殖能力，并且降低了其對化療藥物奧沙利鉑的藥物敏感性，進一步發現其作用機制可能是通過靶向PEA15 發揮作用的。以上研究提示miRNA-4497 可能為Rb 的潛在治療靶點，但仍需進一步實驗證明。