解郁升陽通竅方對慢性高眼壓兔視網膜保護作用的研究

戴敏，亢澤峰，褚文麗，胡竹林，鄭志坤，李妍

青光眼是當今世界上主要的致盲性眼病之一。通過藥物或手術降低眼壓是治療青光眼的唯一有效措施，對于延緩青光眼的病程有明顯效果。然而，單純降眼壓治療并不能從根本上解決視網膜神經節細胞（retinal ganglion cells，RGCs）死亡引起的視功能損害[1-2]。RGCs 的病理改變和凋亡在青光眼的發病過程中起著重要的作用，如何有效的保護視網膜及RGCs，對于青光眼的治療具有重要意義。目前，西醫在青光眼的視神經保護方面一直沒有突破性進展，中醫藥臨床應用歷史悠久，治療青光眼有其獨到之處。大量的實驗與臨床研究[3-6]顯示，中醫藥治療不僅能夠降低眼壓，而且在青光眼視神經保護、視功能改善等方面具有很大的潛力和優勢。本研究采用中醫眼科專家亢澤峰教授在臨床應用于青光眼患者視神經保護治療的經驗方——解郁升陽通竅方（Jieyu Shengyang Tongqiao formula，JSTF）對慢性高眼壓兔進行干預，觀察其對視網膜形態結構及RGCs 的保護作用。從而為JSTF 在青光眼的臨床應用提供一定實驗研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級成年新西蘭大白兔（36 只，雌雄不限，體重2.5～3.0 kg），由昆明醫科大學實驗動物學部提供（動物許可證號：SYXK（滇）K2015-0002），實驗動物的飼養和使用符合國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。實驗動物倫理審批號：KPRC-IACUC17008。

1.2 試劑與儀器

將150 mg 卡波姆-940（索萊寶公司）和1.25 mg地塞米松（索萊寶公司）配制成含0.025%地塞米松的0.3%復方卡波姆溶液50 ml，pH 值為4.0，高壓滅菌，置于4℃冰箱保存備用。配制2%戊巴比妥鈉溶液（戊巴比妥鈉，德國默克公司），過濾除菌，置于4℃冰箱保存備用。鹽酸奧布卡因滴眼液（日本參天制藥公司），兔抗人Caspase-3 多克隆抗體（美國genetex 公司），蘇木素-伊紅染色實驗相關試劑由云南省第二人民醫院病理科提供；Tono-pen XL 筆式眼壓計（美國Mentor 公司）。

1.3 實驗藥物

JSTF 藥物組成：生黃芪50 g、當歸尾9 g、柴胡9 g、枳實9 g、生白芍9 g、青皮6 g、郁金9 g、枸杞子12 g、石斛12 g、升麻6 g、冰片0.6 g（用酒溶化）。中藥由云南省第二人民醫院提供，中藥浸膏由云南中醫藥大學制備。

1.4 方法

1.4.1 慢性高眼壓模型的建立 兔耳緣靜脈注射2%戊巴比妥鈉20 mg/kg 麻醉動物，0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液滴眼局部麻醉。右眼為正常眼，左眼為實驗眼。每眼均在1 ml 注射器角膜緣穿刺抽取0.1 ml房水后，正常組注射0.9%氯化鈉注射液0.1 ml，高眼壓模型組及各中藥治療組前房內注射0.3%復方卡波姆溶液0.1 ml。慢性高眼壓模型以眼壓升高大于22 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），并能持續1 周為標準[7]。模型組及中藥治療組如眼壓<22 mm Hg，7 d后按上述方法重復注藥1 次。

1.4.2 動物分組與處理 造模前用裂隙燈、顯微鏡、眼底鏡檢查眼前節及眼底無異常，Tono-pen XL 筆式眼壓計連續測量眼壓3 d，每日1 次，眼壓＜17 mm Hg[8]的兔子方可采用。隨機分為正常組（NG），模型組（MG），高、中、低濃度JSTF 治療組（HCG、MCG、LCG）共5 組，每組6 只；另外還有6 只分別為建立高眼壓模型1周組3 只，高眼壓模型2 周組3 只。每日監測術眼眼壓并觀察眼前節變化，造模后1 個月處死動物，摘除眼球，觀察相應指標。

JSTF 中藥灌服：按照不同種實驗動物間用藥量換算方法[7]換算得到不同濃度JSTF 治療組兔需灌服中藥量（低濃度JSTF 治療組：1.67 g·kg-1，中濃度JSTF治療組：5.02 g·kg-1，高濃度JSTF 治療組：15.06 g·kg-1）。造模成功后第1 d 開始給藥，中藥治療組每日予JSTF 灌服；模型組以中濃度JSTF 治療組等體積蒸餾水灌服；正常組不做處理，常規飼養。

1.5 蘇木素-伊紅染色觀察視網膜組織形態變化

在模型建立后不同時間點（1 周、2 周、1 個月）及不同濃度中藥治療后，耳緣靜脈注射空氣處死動物，沿角膜緣剪開球結膜，分離眼球。將眼球置于40 g·L-1多聚甲醛固定24 h，脫水后加入適量包埋劑，制成石蠟切片。蒸餾水沖洗，蘇木素染色5～10 min，自來水沖洗，10g·L-1鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，伊紅復染2～5 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察眼球組織形態變化，并在顯微鏡下選取視盤周圍5 mm 內的視網膜標本，置于400 倍顯微鏡下進行觀察拍照，用10×10 目網格（1 mm2）計算10 個方格中RGCs 數量，每只眼計數3 張切片，每張切片取3 個視野，取平均值。

1.6 視網膜神經元Caspase-3 蛋白表達的檢測

采用免疫熒光染色法，將眼球置于4%多聚甲醛固定2 h，之后去除眼前節組織繼續固定24 h。30%蔗糖溶液脫水后加入冰凍包埋劑，制成冰凍切片。4%多聚甲醛固定30 min，1%TritonX-100 作用15 min，增加細胞膜的通透性，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉30 min，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育l h，洗去多余的二抗，DAPI染核，最后用抗淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察，細胞漿呈紅色熒光為陽性細胞。用image pro plus 6.0 圖像分析系統分析，對染色陽性物質進行熒光強度測定，在200 倍光學顯微鏡下每張切片隨機選取5 個視野，計算平均熒光強度值。

1.7 統計學方法

采用GraphPad Prism 7.0 統計軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，多組間的兩兩比較用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 眼壓

注入0.3%復方卡波姆溶液后，兔眼壓逐漸升高，3 d 后開始穩定升高，至模型建立1 個月后眼壓仍可以維持在較高水平。造模后1 個月，各組間眼壓比較差異有統計學意義（F=129.200，P=0.000）。與正常組比較，其他4 組眼壓均升高，差異均有統計學意義（tMG=15.950，tLCG=20.950，tMCG=20.900，tHCG=15.230，均P=0.000）。與模型組比較，各JSTF 治療組差異均無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 5 組眼壓比較（，mm Hg，n=6）

表1 5 組眼壓比較（，mm Hg，n=6）

注：* 與正常組比較，P＜0.05。JSTF 解郁升陽通竅方

2.2 眼前節的變化情況

造模后第1 d，角膜透明，角膜緣血管開始出現充血。隨著造模時間延長，兔眼球結膜混合充血，角膜緣血管迂曲、擴張，角膜水腫，前房加深，瞳孔偏大。造模后1 周，部分兔眼前房出現灰白色團塊狀滲出，之后逐漸吸收。隨著高眼壓模型建立時間延長至1 個月時，兔眼結膜充血減輕，角膜緣血管迂曲擴張程度及角膜水腫也逐漸減輕（圖1）。

圖1 慢性高眼壓模型兔的眼前節改變。1A 造模前；1B 造模后第1 d；1C 造模后1 周；1D 造模后2 周；1E 造模后1 個月

2.3 視網膜組織形態變化

造模前視網膜各層組織結構清晰，神經纖維排列整齊緊密，RGCs 排列緊密，細胞體積一般較大，邊緣清楚，核呈圓形或略呈卵圓形，部分有明顯核仁。造模后1 周，可見RGCs 部分消失，內核層神經細胞減少，可見空泡，視網膜開始變薄。之后隨高眼壓時間延長，RGCs 及內核層神經細胞進一步減少，視網膜進一步變薄。造模后1 個月，內層視網膜結構紊亂，RGCs 及內核層神經細胞大量丟失，視網膜明顯變薄（圖2）。

圖2 高眼壓模型建立不同時間點兔視網膜組織形態變化（×400）。2A 造模前；2B 造模后1 周；2C 造模后2 周；2D 造模后1 個月

造模后1 個月，采用不同濃度JSTF 治療的模型兔眼內層視網膜結構紊亂減輕，RGCs 及內核層神經細胞數量增多，視網膜變薄程度減輕（圖3）。

圖3 造模后1 個月各組視網膜組織形態變化（×400）。3A 正常組；3B 模型組；3C 低濃度JSTF治療組；3D 中濃度JSTF治療組；3E 高濃度JSTF治療組；JSTF 解郁升陽通竅方

2.4 視網膜RGCs 計數

造模后1 個月，5 組間RGCs 計數比較差異有統計學意義（F=3031.000，P=0.000）。與正常組相比，其他4 組RGCs 數量明顯減少，差異均有統計學意義（tMG=164.800，tLCG=101.400，tMCG=64.190，tHCG=47.100，均P=0.000）；與模型組比較，不同濃度JSTF 治療組RGCs 數量明顯增多，差異均有統計學意義（tLCG=27.950，tMCG=53.790，tHCG=43.320，均P=0.000）；與低濃度JSTF治療組相比，中、高濃度JSTF 治療組RGCs 數量增多，差異均有統計學意義（tMCG=24.760，tHCG=22.410，均P=0.000）；與中濃度JSTF 治療組相比，高濃度JSTF治療組RGCs 數量升高不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05）（表2）。

表2 5 組視網膜RGCs 計數比較（，個/10 mm2，n=6）

表2 5 組視網膜RGCs 計數比較（，個/10 mm2，n=6）

注：* 與正常組相比，P＜0.05；# 與模型組相比，P＜0.05；&與低濃度JSTF 治療組相比，P＜0.05。RGCs 視網膜神經節細胞；JSTF 解郁升陽通竅方

2.5 視網膜Caspase-3 蛋白表達變化

根據2.4 所獲得的結果，選擇中濃度JSTF 對慢性高眼壓模型兔進行治療后，觀察Caspase-3 蛋白表達變化。正常組、模型組及中濃度JSTF 治療組均可見Caspase-3 蛋白陽性表達，表現為各層視網膜神經元胞漿紅色熒光（圖4）。正常組Caspase-3 蛋白僅有少量表達，中濃度JSTF 治療組及模型組Caspase-3 蛋白熒光強度均較正常組明顯增高（tMCG=79.470，tMG=19.820，均P=0.000），中濃度JSTF 治療組Caspase-3 蛋白熒光強度較模型組降低（t=44.510，P=0.000）（表3）。

圖4 造模后1 個月各層視網膜神經元Caspase-3 蛋白表達變化（×200）。紅色熒光代表Caspase-3 蛋白的陽性表達；藍色熒光代表DAPI 染色的視網膜各層細胞核；DAPI 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；Merge Caspase-3 與DAPI 染色的合成圖；JSTF 解郁升陽通竅方

表3 3 組各層視網膜神經元Caspase-3 蛋白表達比較（，n=6）

表3 3 組各層視網膜神經元Caspase-3 蛋白表達比較（，n=6）

注：* 與正常組相比，P＜0.05；# 與模型組相比，P＜0.05。JSTF 解郁升陽通竅方

3 討論

目前青光眼的病情進展仍然是以降眼壓來控制。然而，控制眼壓并不是唯一治療目標。早期有效地進行視神經、視網膜的保護，減少RGCs 的凋亡，保護患者的視功能是治療青光眼的最終目的。然而青光眼視神經保護的藥物療效存在一定的局限性。中醫中藥具有整體觀念和辨證論治的治療特色，其通過調節全身的臟腑、經絡及精氣血津液以改善機體的微環境，在保護視神經方面具有一定優勢。亢澤峰教授認為肝腎虛損、脈絡瘀滯是青光眼視神經損害的主要病機，故以“解郁開竅，升陽明目”作為青光眼視神經保護的首要治則。通過長期臨床實踐，總結并創立了青光眼視神經保護經驗方“解郁升陽通竅方”。方中以黃芪、柴胡共為君藥，益氣健脾，疏肝解郁，升舉陽氣；當歸具有補血活血之功，合黃芪可達補氣生血、養血潤目之效，白芍養血斂陰柔肝，合柴胡可達補血養肝，條達肝氣之功，兩者皆為臣藥；枳實、青皮、郁金共奏疏肝理氣、解郁開竅之功，枸杞子合石斛滋補肝腎、益精明目，共為佐藥；后以升麻升舉陽氣、載藥上行，冰片開竅解郁、引藥上行為使。諸藥共奏解郁開竅，升陽明目之功。

為進一步探討JSTF 改善患者視功能的機制，課題組采用慢性高眼壓兔來進行研究。結果發現，與正常組相比，不同濃度JSTF 治療組的眼壓與模型組無明顯差異，說明JSTF 并無降眼壓的作用。采用不同濃度JSTF 治療后1 個月，兔眼內層視網膜結構紊亂減輕，視網膜變薄程度減輕，RGCs 數量也較模型組增多。說明JSTF 對慢性高眼壓兔視網膜及RGCs 具有保護作用。Caspase 蛋白酶在哺乳動物細胞中介導凋亡，是觸發細胞凋亡的關鍵酶[9-10]，有研究[11]發現，氧化應激在細胞凋亡中有著重要作用。活性氧的產生能夠激活Caspase-3，激活Caspase 依賴性細胞凋亡，在觸發神經元死亡中起關鍵作用[12-15]。研究發現，正常組Caspase-3 蛋白僅有少量表達，JSTF 治療組及高眼壓模型組Caspase-3 蛋白熒光強度均較正常組增高，而JSTF 治療組Caspase-3 蛋白熒光強度較模型組降低。說明JSTF 對慢性高眼壓兔RGCs 的保護作用可能與其能夠抑制Caspase-3 的表達、減少RGCs 的凋亡有關。

本研究為JSTF 對青光眼患者視網膜及RGCs的保護作用提供了實驗基礎，為中藥方劑對改善青光眼患者視功能的有效性提供了可靠依據。然而，JSTF 通過何種途徑抑制Caspase-3 的表達以及如何減輕視網膜結構紊亂的具體機制仍需在以后的研究中進一步探索。