結(jié)直腸癌患者血液游離DNA水平與病理特征的關(guān)系

魯振環(huán)，張濤，朱曉峰，曾德強

（廣東省韶關(guān)市粵北人民醫(yī)院 胃腸外科，廣東 韶關(guān) 512025）

0 引言

結(jié)直腸癌是臨床常見惡性腫瘤，流行病學調(diào)查顯示其發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤第四位，且其發(fā)病有年輕化趨勢[1]。結(jié)直腸癌的早期診斷是改善患者預后的關(guān)鍵，游離DNA是由單鏈和雙鏈DNA組成的無細胞形態(tài)的DNA，既往有報道顯示腫瘤微轉(zhuǎn)移灶和細胞裂解可增加游離DNA表達量[2-3]，推測游離DNA可能參與結(jié)直腸癌變過程，本研究回顧性分析醫(yī)院60例接受血清循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）檢測患者的臨床資料，探討cfDNA與結(jié)直腸癌病理特點的關(guān)系，為結(jié)直腸癌的早期診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準，采用簡單隨機抽樣法選取醫(yī)院2018年9月至2019年9月60例接受cfDNA檢測的患者作為研究對象，對其臨床資料進行回顧性分析。其中30例經(jīng)病理活檢確診為結(jié)直腸癌[4]，為觀察組，其中男18例，女12例；年齡（49.62±9.05）歲；體重指數(shù)（20.79±2.31）kg/m2。另30例為結(jié)腸息肉患者，為對照組，其中男21例，女9例；年齡（47.91±8.65）歲；體重指數(shù)（20.55±2.08）kg/m2。兩組患者性別、年齡、體重指數(shù)等基本資料無顯著性差異（P＞0.05），具有可比性。

1.2 實驗試劑和方法。在患者入院后24 h內(nèi)空腹采集肘靜脈血5 mL，3000 r/min離心10 min，留取血清于EP管內(nèi)，-700C凍存?zhèn)溆谩＿x用Qiagen公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒，游離DNA提取方法參照試劑盒說明進行。利用 Invitrogen 公司生產(chǎn)的 Sybr Green 定量 PCR 預混液進行。利用分子生物學軟件DNAStar對GenBank中登錄的PPIA基因序列進行分析，再用PrimerSelect軟件在基因保守區(qū)域設(shè)計檢測引物，并對引物進行二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)等分析，篩選出2對引物，序列分別為PPIA-116F：AAG AAG TGA CTG CTC ATC TA，PPIA-116R：AAG CAC TGC TGCACG ATC A；PPIA-132F：ACA TGG GTA CTA AGC AAC AAA ATA AG；PPIA-132R：CAC AAT TGG AAC ATC TTT GTT AAA C，合成PPIA基因片段。25 ul總反應體系中包含 12.5ul 2 X預混反應液，正反向引物（10uM）各 1ul，DNA 5ul，雙蒸水5.5 ul，反應條件為95°10 min，40個循環(huán)的95°15 s-60度1 min，在60°收集熒光信號，采用熒光定量PCR儀測量Ct值，利用滅菌純水提取質(zhì)粒DNA，稀釋后取5個梯度標準品，以熒光定量PCR作標準曲線，根據(jù)公式計算樣本中cfDNA濃度。cfDNA濃度=標準曲線確定樣品拷貝數(shù)/反應中血漿體積。

1.3 觀察指標。比較不同性別、年齡、體重指數(shù)、腫瘤分類、分期及腫瘤直徑患者cfDNA濃度。采用受試者工作曲線（receiver operating characteristic，ROC）分析cfDNA濃度判斷結(jié)直腸癌的價值，結(jié)果以曲線下面積（area under the curve，AUC）表示，以AUC＞0.75為應用價值高。

1.4 統(tǒng)計學方法。選用SPSS 22.0軟件包處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩兩比較行t檢驗，計數(shù)資料以百分比表示，兩兩比較行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組cfDNA濃度比較。觀察組患者cfDNA濃度為（413.16±104.43）ng/ mL，對照組為（276.33±97.46）ng/mL，兩組cfDNA濃度比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.247，P=0.001）。

2.2 不同特征結(jié)直腸癌患者cfDNA濃度比較。不同腫瘤直徑患者cfDNA濃度差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），不同性別、年齡、體重指數(shù)、腫瘤分類及分期的結(jié)直腸癌患者cfDNA濃度比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）.見表1。

表1 不同特征結(jié)直腸癌患者cfDNA濃度比較

2.3 cfDNA濃度判斷結(jié)直腸癌的價值分析。以cfDNA濃度為檢驗變量，以是否為結(jié)直腸癌為狀態(tài)變量，繪制ROC曲線。見圖1，結(jié)果顯示其AUC為0.759（S.E.=0.062，95%CL=0.638-0.881，P=0.001）。靈敏度為0.867，特異度為0.567，最佳截斷值為373.50 ng/mL。

圖1 cfDNA濃度判斷結(jié)直腸癌的ROC分析

3 討論

結(jié)直腸癌的早期診斷對提高臨床治療效果和改善患者預后具有重要意義，而腫瘤標記物作為非損傷性實驗室指標，被公認為是結(jié)直腸癌早期篩查的重要依據(jù)[5]。近年來有學者發(fā)現(xiàn)外周血血清中存在來源于腫瘤細胞微轉(zhuǎn)移灶的特異性DNA[6]，這可能有助于結(jié)直腸癌的早期診斷。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸良惡性患者間cfDNA水平差異顯著，提示cfDNA濃度可作為診斷結(jié)直腸癌的依據(jù)之一，Rui Zhang等[7]還認為血清cfDNA濃度與結(jié)腸早期病變程度具有顯著相關(guān)性。而分子實驗則發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤進展，腫瘤細胞被巨噬細胞吞噬，使cfDNA濃度逐漸增加[8-10]。因而，cfDNA濃度檢測有望成為早期診斷結(jié)直腸癌的無創(chuàng)指標。

本研究還發(fā)現(xiàn)不同腫瘤直徑患者cfDNA濃度差異顯著，這可能是因隨著腫瘤生長，更多的cfDNA被釋放入血所致。Barault L等還認為cfDNA濃度與腫瘤負荷相關(guān)，也說明cfDNA參與腫瘤增殖生長。本研究采用ROC分析顯示cfDNA判斷結(jié)直腸癌的AUC為0.759，提示cfDNA有助于結(jié)直腸癌的早期診斷。另外，李禹龍等報道還發(fā)現(xiàn)不同cfDNA濃度患者總生存期差異顯著，提示監(jiān)測cfDNA濃度有助于預后判斷，cfDNA濃度可能與結(jié)直腸癌的惡性程度相關(guān)，但其具體原因還有待進一步研究。本研究隨訪時間較短，未行不同cfDNA濃度患者預后比較，這有待今后延長隨訪時間觀察。

綜上所述，不同結(jié)直腸癌腫瘤直徑患者cfDNA濃度差異顯著，檢測cfDNA濃度有助于結(jié)直腸癌的早期診斷。