CRNDE調節miR-126-5p減弱患兒膿毒癥腦損傷的機制研究

張晶 代思華 王曉巖 谷麗彩 黃蕊 任常軍

膿毒癥是指由感染因素引起的全身炎性反應綜合征，嚴重時可導致器官功能障礙[1]。膿毒癥相關性腦病(sepsis-associated encephalopathy,SAE)是膿毒癥患者嚴重的中樞神經系統并發癥。主要表現為為記憶力下降，注意力不集中，定向障礙，易激惹，精神恍惚甚至昏迷等不同程度的認知功能障礙。其發病機制可能與腦血管功能障礙、氨基酸及神經遞質異常、炎性損傷、氧化刺激和谷氨酸興奮毒性等有關[2]。在膿毒癥介導的腦損傷發生發展過程中伴隨多種基因、RNA、蛋白的表達改變和功能異常，而有效調節這些異常的分子表達可能減輕膿毒癥介導的腦損傷。長鏈非編碼RNA(lncRNAs)和微小RNA(microRNAs)同屬于非編碼RNA，其異常表達及相互作用在腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用，可能是膿毒癥新的治療靶點[3,4]。結直腸腫瘤差異表達(colorectal neoplasia differentially expressed,CRNDE)是結直腸腫瘤差異表達長鏈非編碼RNA，在許多癌組織和癌細胞中表達出現異常[5,6]。miRcroRNA-126-5p (miR-126-5p)由人類染色體轉錄的前體RNA剪切而來，miR-126-5p作為微小RNA在宮頸癌、非小細胞中表達下調[7,8],然而，CRNDE和miR-126-5p在膿毒癥患兒腦損傷中作用的研究較少。本研究研究CRNDE在膿毒癥患兒腦損傷中的功能和作用機制，為臨床上治療膿毒癥患兒相關性腦損傷提供新的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2019年1月本院收治的30例膿毒癥誘導腦損傷患兒作為研究對象，其中男11例，女19例；年齡2個月～10歲，平均(4.51±1.63)歲。同時，健康對照組30例，均為同期本院兒童保健科體檢的健康兒童，其中男12例，女18例；年齡2個月～10歲，平均(5.19±2.14)歲。在研究開始之前，所有參與者家長簽署了知情同意書，并經過醫院倫理委員會討論通過。

1.2 試劑與儀器 TRIzol購自美國Invitogen公司，DMEM和胎牛血清購自美國Biological Industries公司，CCK-8試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司，RNA提取試劑盒和定量PCR試劑盒SYBR premix Ex TaqTM購自日本TaKaRa公司。

1.3 細胞培養 根據資料[9]培養原代星形膠質細胞。取1～2 d新生的C57小鼠，小心分離出大腦皮質腦組織，采用適量0.125%的胰蛋白酶消化腦組織，后用10%FBS的完全培養基終止消化，離心后加入適量20%FBS的完全培養基重懸腦組織，按照每個T75培養瓶接種10 ml懸液的量接種，在37℃恒溫培養箱中培養；24～36 h后棄培養基，用無菌DMEM培養基輕柔洗滌2次，連續培養10～12 d后，在光學顯微鏡下可見大量折光性強的細胞，以200 r/min的速度在37℃恒溫搖床上連續搖晃30 min，使強折光細胞脫落；倒掉培養瓶中細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，加入適量10%完全培養基重懸并接種到細胞板中并待用；留在培養瓶的細胞絕大多數為星形膠質細胞，采用上述方法搖晃細胞3次，以去除殘留的小膠質細胞和少突膠質細胞，加0.25%胰蛋白酶消化并接種后留用。采用10 μg/ml LPS(Sigma,St.Louis,MO,USA)處理HSAECs細胞24 h，刺激體外LPS誘導膿毒癥模型。

1.4 細胞轉染 將經LPS處理的HSAECs細胞以 5×106/cm2接種于6孔板，保證轉讓時細胞匯合度>80%。miR-195-5p mimics，miR-195-5p inhibitors，CASC9過表達質粒，sh-CASC9購于廣州RiboBio Co,Ltd.(Guangzhou,China)。轉染操作嚴格按照Lipofectamine 2000(Invitrogen,California,USA)試劑盒說明書進行操作。用qRT-PCR檢測轉染效率。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應 從組織和細胞中提取RNA，采用Promega公司逆轉錄試劑盒,按操作說明進行將RNA逆轉錄成 cDNA。根據制造商的說明，RT-RCR是在ABI 7500實時PCR系統上與SYBR premix EX TAQ II一起進行的。以GAPDH和U6為內參分別檢測CRNDE和miR-126-5p的表達水平，并用2-ΔΔCt法進行統。其中:CRNDE的引物序列正向：5’-GAGGACGTGCTGGGGCT-3’,反向 5’-CTGAGTCCATGTCCCGAATC-3’；miR-126-5p的引物序列是正向5′-ACACTCCAGCTGGGTCGTACCGT-GAGTAAT-3’，反向5’-TGGTGTCGTG-GAGTCG-3’；內參U6的引物序列是正向5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，反向5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。內參GAPDH的引物序列是正向5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’，反向5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’。

1.6 雙熒光素酶報告基因法 野生型CRNDE及突變型CRNDE的目的片段被構建并整合入pGL3 vector (Promega,Madison,WI,USA)以構建 pGL3-CRNDE-wild type (CRNDE-wt)和pGL3-CRNDE-mutant (CRNDE-mut) reporter vector。將CRNDE-wt或CRNDE-mut與miR-126-5p mimics或陰性對照物共轉染細胞。轉染48 h后，檢測熒光素酶活性。每組各設3個重復孔，重復3次。

1.7 MTT法 第1天將星形膠質細胞種在96孔培養板中(5×103細胞/孔)，第2天細胞密度達到約70%時，按LipofactamineTM2000說明書進行轉染。分別在轉染24 h進行MTT檢測。每孔加入MTT(5 g/L)10 μl，繼續孵育4 h，棄培養液后再加入甲基亞砜(DMSO)，避光振蕩10 min至結晶充分溶解，空白對照調零，并用酶標儀測定570 nm波長處吸光度值。

1.8 免疫印跡(Western Blot) 免疫印跡檢測凋亡相關的B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)和BCL2-Associated X蛋白(Bax)，以及NF-κB、Keap1、Nrf2的表達情況。將轉染的星形膠質細胞培養48 h。收集細胞，加入RIPA裂解重懸細胞，超聲破碎、1 200 r/min，4℃條件下離心10 min，按照BCA試劑盒(Thermo, Shanghai, China)說明書測定總蛋白濃度。每個樣本取30 μg經SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉至PVDF上。5%脫脂牛奶封閉PVDF膜60 min，加入相應比例的一抗Anti-Bcl-2 antibody (ab196495, Abcam,1∶1 000)、Anti-Bax antibody (WL01637，Wanleibio, 1∶1 000)，Anti-NFkB p105/p50 antibody (ab32360, Abcam, 1∶1 000)、Anti-Keap1 antibody(ab196346，Abcam，1∶1 000)、Anti-Nrf2 antibody(ab137550, Abcam ，1∶1 000) 4℃下過夜，洗膜后加入相應的二抗，室溫孵育120 min，滴加顯影液顯影，觀察條帶。實驗重復3次。GAPDH為內參。

1.9 酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 肺組織稱重后，加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液進行勻漿，4℃下14 000 g離心25 min，留取上清液。ELISA試劑盒(Invitrogen,Waltham,MA,USA)分別檢測細胞上清液腫瘤壞死因子TNF-α(tumornecro sisfactor，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、氧化應激因子(SOD、MDA)的含量，嚴格按試劑盒要求操作，具體步驟：(1)包被過程(設置空白對照，陰性對照)：將所用抗原用包被稀釋液稀釋到適當濃度，每孔抗原加入100 μl,置37℃，4 h，棄去孔中液體。(2)封閉酶標反應孔：5%小牛血清置37℃封閉40 min。封閉時將封閉液加滿各反應孔；封閉結束后用洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍3 min。(3)加入待檢細胞上清液：將稀釋好的細胞上清液加入酶標反應孔中，每樣品至少加3孔，每孔100 μl，置于37℃，60 min。然后，用洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍3 min。(4)加入酶標抗體：根據說明書稀釋，每孔加100 μl ，37℃，40 min。然后，用洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍3 min。(5)加入底物液(現用現配)：每孔100 μl，置37℃避光放置5 min。(6)終止反應：加入終止液顯色，每孔加入終止液50 μl終止反應,于20 min內測定實驗結果。(7)結果判斷：酶標儀于490 nm讀取吸光度值。

2 結果

2.1 在膿毒癥腦損傷患兒血清中CRNDE下調，而miR-126-5p上調 RT-PCR結果顯示，在膿毒癥患兒血清中CRNDE的水平顯著下調(P<0.01)，而miR-126-5p的水平上調(P<0.01)。見表1。

表1 2組CRNDE和miR-126-5p表達水平比較

2.2 上調CRNDE對LPS誘導的星形膠質細胞增殖的影響 LPS顯著降低了星形膠質細胞細胞中CRNDE的表達水平(P<0.05)。我們采用MTT法檢測了10 μg/ml LPS誘導的星形膠質細胞培養24 h的吸光度值，結果顯示，在LPS誘導的星形膠質細胞中過表達CRNDE后，星形膠質細胞的增殖水平上調(P<0.05)。見表2、3。

表2 RT-PCR檢測星型膠質細胞CRNDE的表達水平

表3 RT-PCR和MTT法檢測LPS誘導的星型膠質細胞CRNDE的表達水平

2.3 上調CRNDE對LPS誘導的星形膠質細胞凋亡的影響 在探究了上調CRNDE對LPS誘導的星形膠質細胞增殖的影響后，我們探究了上調CRNDE對LPS誘導的星形膠質細胞凋亡的影響，Western blot結果顯示，上調LPS誘導的星形膠質細胞中CRNDE的水平后，細胞中Bax的水平顯著下調，而Bcl2的水平上調。見圖1。

圖1 LPS誘導的星形膠質細胞凋亡相關蛋白表達情況

2.4 上調CRNDE對炎性因子和氧化應激因子的影響 為了進一步探究CRNDE在膿毒癥腦損傷中的作用，我們檢測了LPS介導的星形膠質細胞中炎癥因子(TNF-α、IL-1β)、炎癥相關蛋白(NF-κB)、氧化應激因子(SOD、MDA)、氧化應激相關蛋白(Keap1、Nrf2)的水平。ELISA和western blot結果顯示，上調CRNDE后，LPS介導的星形膠質細胞中TNF-α、IL-1β、NF-κB、MDA、Keap1的水平下調，而SOD和Nrf2的水平上調(P<0.05)。見表4，圖2。

圖2 LPS介導的星形膠質細胞中炎癥、氧化應激相關蛋白的表達情況

表4 ELISA法檢測LPS介導的星形膠質細胞分泌炎癥、氧化應激相關因子的水平

2.5 CRNDE靶向miR-126-5p 為了進一步探究CRNDE調控AHI的下游分子機制，我們通過StarBase數據庫(http://www.starbase.com)進行了生物信息學分析，數據顯示CRNDE含有miR-126-5p的保守結合位點。為了進一步驗證CRNDE與miR-126-5p的結合關系，我們采用雙熒光素酶報告法進行檢測。雙熒光素酶報告試驗表明，miR-126-5p模擬物可降低含CRNDE-wt的熒光素酶報告體的熒光素酶活性，而對CRNDE-mut載體的熒光素酶活性沒有顯著影響(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3 生物信息學數據顯示CRNDE含有miR-126-5p的保守結合位點

表5 雙熒光素酶報告試驗驗證CRNDE與miR-126-5p的結合關系

3 討論

膿毒癥介導的腦損傷由多種炎性介質和效應細胞共同調控，其潛在機制是肺巨噬細胞產生過度表達的促炎性細胞因子和炎性介質導致機體的免疫紊亂[10]。核因子-κB(NF-κB)能調節多種參與缺血再灌注損傷的細胞因子、炎性介質、黏附分子的基因轉錄過程，從而控制它們的生物合成，在炎性反應中起著非常關鍵的作用[11]。有研究表明，膿毒癥多器官功能障礙及損傷時常伴有NF-κB信號轉導通路的上調活化[12]。在本研究中，我們發現膿毒癥ALI大鼠血清中TNF-α、IL-1β表達水平顯著上調，NF-κB活性明顯升高，這與以往報道一致。此外，膿毒癥不僅與炎性反應有關，而且與活性氧(ROS)的產生和抗氧化因子表達失衡有關[13,14]。

Keap1(Kelch-like ECH-as-sociated protein 1)是一種細胞質肌動蛋白結合蛋白，Nrf2-Keap1是機體氧化應激系統重要的信號通路[15]。生理狀態下，細胞質中的Nrf2和Keap1相結合并處于相對抑制狀態而不會從胞漿進入胞核內激活下游信號，當受到ROS和親電子刺激，發生氧化應激時，Nrf2和Keap1解離，Nrf2轉移到細胞核內與下游ARE結合，啟動ARE下游的抗氧化蛋白或促氧化蛋白合成酶等基因轉錄和表達以抵抗內外界的有害刺激[16]。

在本研究中觀察到，在膿毒癥患兒血清中中氧化應激指標MDA顯著上調，SOD下調，氧化應激相關蛋白Keap1上調，而Nrf2下調，進一步證實了膿毒癥可以介導顯著的炎性反應和氧化應激反應。

研究報道,高表達lncRNA NEAT1與膿毒癥患者的風險增加、預后不良、促炎細胞因子的高表達顯著相關[17]。有趣的是，lncRNA Lethe在膿毒癥腦損傷中表達下調，能夠通過調節皮層神經元的自噬減弱膿毒癥介導的腦損傷[18]。近年來，CRNDE在炎癥的進展中發揮了重要的作用，例如，CRNDE通過上調WI-38細胞中的FOXM1加速了LPS誘導的細胞凋亡和炎癥[19]。在本研究中，我們首先發現CRNDE抑制膿毒癥相關性腦損傷的進展。

在脾巨噬細胞中miR-146a可減弱炎癥和膿毒癥引起的多器官損傷[20]。厚樸醇通過靶向調節miR-218-5p/血紅素加氧酶-1信號通路減輕膿毒癥誘導的急性腎損傷[21]。miR-126-5p通過抑制慢性HIV-1感染中的圓柱狀瘤，增強單核細胞對脂多糖刺激的炎性反應[22]。在本研究中，我們首先發現miR-126-5p在膿毒癥患兒血清和LPS作用的星形膠質細胞中表達顯著上調，而過表達miR-126-5p可以顯著抑制肝上皮細胞的增殖并促進肝上皮細胞的凋亡，提示miR-126-5p可以加快盲腸結扎穿孔致膿毒癥介導的肝損傷的進程。

最近，lncRNAs通過與miRNAs相互作用并抑制其作用而起到ceRNA或miRNA sponge的作用。例如，在膿毒癥中，lncRNA NEAT1可以通過靶向抑制miR-125增加MCEMP1(mast cell-expressed membrane protein 1,MCEMP1)的表達對膿毒癥小鼠的免疫抑制發揮促進作用，這可能是膿毒癥治療的潛在靶標[23]。此外，LncRNA HOTAIR可通過下調miR-34a/Bcl-2信號通路抑制腎組織細胞凋亡，從而減輕膿毒癥大鼠的AKI[24]。此外，有研究表明，CRNDE靶向調節miR-181a-5p促進結直腸癌細胞的增殖和轉移[25]；lncRNA HOTAIR作為一種競爭性內源性RNA，通過靶向抑制miR-126-5p促進膠質瘤進展[26]。我們探究了CRNDE與miR-126-5p的潛在相互作用。相關數據證明了CRNDE可能是LPS誘導的星形膠質細胞中的miR-126-5p sponge。

綜上所述，我們的研究首次證明CRNDE在膿毒癥腦損傷患兒血清和LPS誘導的星形膠質細胞中表達下調。功能性實驗證實CRNDE通過調節miR-126-5p減弱膿毒癥腦病，是一個有價值和有前景的膿毒癥患兒腦損傷治療靶點。