miR-127-5p下調PTEN的表達促進非小細胞肺癌細胞自我更新和侵襲

伍思蓉，蔡 霈，袁 慶，曹建國，楊小平，2，張堅松*

(1.湖南師范大學醫學院，中國 長沙 410006；2.湖南省小分子靶向藥物研究與創制重點實驗室，中國 長沙 410006；3.湖南省婦幼保健院藥劑科，中國 長沙 410013)

肺癌是全世界最常見的癌癥死亡原因之一，每年估計有160萬人死亡[1]。肺癌可以分為小細胞癌(SCLC)和非小細胞癌(NSCLC)，其中，約85%的肺癌患者具有NSCLC組織學亞型[2]。早在2008年，Eramo團隊發現非小細胞肺癌中存在罕見未分化細胞群，該細胞群高表達CD133，并具有高致瘤性[3]。筆者的前期研究支持上述結果，通過干細胞條件培養懸浮培養可富集具有干細胞特性的球形成細胞，即腫瘤干細胞樣細胞，具有CSCs特性[4]。MicroRNA(miRNA)是長度為18至25個核苷酸的內源性非編碼RNA，涉及廣泛的基本細胞生物學過程，例如細胞分化、增殖、生長、遷移、凋亡以及腫瘤發生[5]。多項研究證明NSCLC中存在大量腫瘤相關miRNAs。通過對GEO數據庫中多個數據集(GSE29248，GSE56036和GSE102287)進行高通量數據的分析發現，miR-127-5p在NSCLC組織中高表達，可能具有腫瘤促進作用。有研究表明，miR-127-5p在多種疾病中具有重要作用，包括肝細胞癌[6]、宮頸癌[7]以及乳腺癌[8]等。因其在NSCLC中的作用及功能還未見研究報道，本研究擬探索miR-127-5p非小細胞肺癌細胞干細胞特性的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

人非小細胞肺癌細胞系 H358和A549購自中國科學院細胞庫(中國上海)，用含10%胎牛血清(FBS)，1×105IU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI-1640培養基置于37 ℃下含5%CO2的增濕培養箱中培養。

1.2 細胞轉染

RNA oligo(包括miR-127-5p mimic, mimic control, miR-127-5p inhibitor以及inhibitor control)購于吉瑪基因(中國蘇州)。取生長狀態良好的H358和A549細胞，待細胞融合度達到70%后根據操作規范進行轉染。取3.75 μL脂質體Lipofectamine 3000用125 μL opti-MEM稀釋，另取18.8 μL RNA oligo(20 μmol·L-1)也用125 μL opti-MEM稀釋。稀釋的 Lipofectamine 3000 和稀釋的 RNA oligo 混合，室溫靜置 5 min，將混合液加入培養液，放入二氧化碳培養箱中繼續培養，24 h后通過實時熒光定量 PCR檢測 miR-127-5p 的表達變化，48 h后檢測蛋白變化。

1.3 實時熒光定量 PCR

用TRIzol (美國Life Technologies公司) 提取總RNA。取 500 ng 總 RNA采用加尾法進行反轉錄。實時定量 PCR 試劑為Power SYBR?Green PCR Master Mix，CT值(閾值循環數)用于定量各組模板的相對量。通過各自的管家基因 U6校正[ΔCT=CT(GENE)-CT(U6)]，再與對照組相比，通過 2-ΔΔCT計算[ΔΔCT=ΔCT(GENE)-ΔCT(control)]。miR-127-5p 前向引物序列為 5’-CGCTCTGTCATTCTGTAGGCCAAT-3’，U6 前向引物序列為 5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’，通用的反向引物序列為5’-GATCGCCCTTCTACGTCGTAT-3’。

1.4 H358和A549球形成細胞培養及球形成率測定

H358和A549細胞以2 000個細胞/孔的密度懸浮在腫瘤干細胞條件培養基中(由無血清DMEM/F12(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，1×105IU·L-1青霉素，100 mg·L-1鏈霉素，20 μg·L-1hbFGF(Invitrogen)，20 μg·L-1hrEGF(Invitrogen)，2%B27(Invitrogen)，4 mg·L-1胰島素(Sigma-Aldrich)和0.4%BSA(Invitrogen)組成)，用超低黏附六孔板培養，每2 d換液一次，每5 d傳代。

用miR-127-5p mimic,mimic control，miR-127-5p inhibitor以及inhibitor control分別轉染H358和A549細胞48 h。隨后，腫瘤干細胞條件培養基進行球培養， 轉染后的H358和A549細胞以2 000個細胞/孔的密度接種于24孔超低黏附培養板 (美國Corning Inc公司) 培養6 d。在顯微鏡下觀察球形成情況。球形成率(%)=每孔形成的腫瘤球均數/每孔接種的活細胞數×100%。

1.5 transwell小室侵襲實驗

miR-127-5p mimic，mimic control，miR-127-5p inhibitor以及inhibitor control分別轉染H358和A549細胞48 h后，胰蛋白酶消化，計數，用無血清培養基重懸，調整細胞濃度為1×109·L-1，取200 μL上述細胞懸液接種于transwell小室(美國Corning Inc公司)的上室，下室加入600 μL含10%FBS的完全培養基。置于37 ℃下含5%CO2的增濕培養箱中孵育24 h后吉姆薩染色，顯微鏡下觀察計數侵襲細胞數。 細胞侵襲率(%)=侵襲細胞數/每孔接種的活細胞數×100%。

1.6 蛋白質印記

按照文獻[4]所述進行蛋白質印記實驗。兔抗人PTEN單克隆抗體作為一抗，購于Cell Signaling Technology(9559S，美國)；兔抗人PCNA單克隆抗體購于Cell Signaling Technology(13110S，美國)。通過Image J軟件測量每個條帶的灰度值。β-actin作為加樣對照。

1.7 熒光素酶報告基因實驗

采用TargetScan等預測miR-127-5p的潛在靶標。根據預測結果，設計PTEN的突變序列和野生序列，并進行克隆。用miR-127-5p mimic或miR-127-5p陰性對照物分別與上述報告基因共轉染293T細胞，測定熒光素酶的相對活性。海腎熒光素酶活性用作標準化對照。

1.8 統計學分析

使用SPSS 20.0軟件(SPSS Inc，Chicago，IL)進行數據分析，數據以3次獨立實驗的平均值±標準差(SD)表示，單因素方差分析(One Way ANOVA)檢驗組間均數的統計學意義，P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 H358和A549球形成細胞中miR-127-5p的表達

筆者前期通過對GEO數據庫中多個關于NSCLC非編碼RNA芯片數據(GSE29248，GSE56036和GSE102287)分析發現，3個芯片數據中miR-127-5p在NSCLC組織中存在差異表達(圖1A)。采用GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)對miR-127-5p的表達進行分析發現，其在NSCLC組織中高表達且有統計學意義(圖1B)。比較非小細胞肺癌H358和A549細胞球形成細胞和親本細胞中miR-127-5p的表達，可發現miR-127-5p在球形成細胞中顯著高表達(圖1C和D)。

圖1 (A) miR-127-5p在GSE29248，GSE56036和GSE102287芯片數據中差異表達；(B)生物信息學分析非小細胞肺癌組織和癌旁組織中miR-127-5p的表達; (C) A549細胞及其球形成細胞中miR-127-5p的表達; (D) H358細胞及其球形成細胞中miR-127-5p的表達

2.2 miR-127-5p對非小細胞肺癌H358和A549細胞球形成的影響

圖2 RNA oligo轉染后H358和A549細胞中miR-127-5p的表達

為了驗證miR-127-5p對非小細胞肺癌H358和A549細胞球形成的影響，筆者分別采用miR-127-5p mimic及miR-127-5p inhibitor轉染H358和A549細胞。如圖2所示，miR-127-5p mimic轉染后，H358和A549細胞中miR-127-5p的表達均顯著增加；相反，miR-127-5p inhibitor顯著下調兩者的miR-127-5p水平，說明轉染效率較高。

隨后，采用球形成實驗檢測miR-127-5p的表達水平對H358和A549細胞球形成的影響。如圖3所示，與mimic control組相比，miR-127-5p mimic顯著促進H358和A549細胞球形成；與inhibitor control組相比，miR-127-5p inhibitor轉染后，球形成率明顯降低。這提示miR-127-5p對H358和A549細胞球形成能力具有促進作用。

2.3 miR-127-5p對非小細胞肺癌A549細胞中PCNA蛋白表達的影響

為進一步驗證miR-127-5p對非小細胞肺癌細胞增殖的影響，筆者分別采用miR-127-5p mimic及miR-127-5p inhibitor轉染A549細胞和H358細胞，隨后檢測其對增殖標記蛋白PCNA表達的影響。結果發現過表達miR-127-5p顯著增加PCNA的表達，miR-127-5p inhibitor轉染組A549細胞和H358細胞中PCNA蛋白表達水平均明顯降低(圖4)，提示miR-127-5p促進非小細胞肺癌細胞增殖。

圖4 miR-127-5p誘導非小細胞肺癌細胞A549(A)和H358(B)中PCNA蛋白的表達

2.4 miR-127-5p對非小細胞肺癌H358和A549細胞侵襲能力的影響

細胞侵襲是反映腫瘤細胞干細胞樣特性的一個重要功能，研究表明腫瘤干細胞樣細胞較親本細胞具有更高的侵襲能力[9]。為了進一步驗證miR-127-5p對非小細胞肺癌細胞干細胞樣特性的影響，筆者采用transwell小室侵襲實驗分別檢測miR-127-5p mimic及miR-127-5p inhibitor轉染對H358和A549細胞侵襲能力的影響。如圖5所示，miR-127-5p mimic可顯著誘導H358和A549細胞侵襲，反之miR-127-5p inhibitor轉染組H358和A549細胞侵襲率明顯降低，提示miR-127-5p可促進非小細胞肺癌細胞侵襲。

圖5 miR-127-5p促進H358和A549細胞的侵襲

2.5 miR-127-5p靶向抑制PTEN的表達

筆者采用TargetScan等預測發現miR-127-5p與PTEN存在結合位點(圖6A)，熒光素酶報告基因實驗驗證了這一推測。miR-127-5p mimic轉染組中WT PTEN報告基因的活性明顯低于mimic control轉染組(圖6B，P=0.004 6)，提示miR-127-5p與PTEN存在直接相互作用。檢測miR-127-5p mimic和miR-127-5p inhibitor轉染后A549細胞中PTEN的表達，如圖6C和D，筆者發現miR-127-5p mimic轉染顯著抑制PTEN的表達，而miR-127-5p inhibitor轉染組A549細胞中PTEN的表達明顯增加。以上結果提示，miR-127-5p靶向下調PTEN的表達。

圖6 (A)生物信息學預測miR-127-5p和PTEN的結合位點；(B)熒光素酶報告基因實驗驗證miR-127-5p和PTEN的相互作用；(C，D)miR-127-5p抑制非小細胞肺癌A549細胞中PTEN的表達

3 討論

MicroRNA(miRNA)是長度為18至25個核苷酸的內源性非編碼RNA，他們通過與靶基因的3′UTR(非翻譯區)結合，在轉錄后水平上調節mRNA的穩定性[10]，因此涉及廣泛的基本細胞生物學過程，例如細胞分化、增殖、生長、遷移和凋亡以及腫瘤發生。亦有研究表明，在非小細胞肺癌中，miRNA參與調節上皮-間質轉化、轉移、侵襲等過程[11,12]。因此，筆者認為：明確各種致癌基因和腫瘤抑制基因的miRNA對認識NSCLC的發生發展可能具有深遠的意義，其可能用于早期檢測和分子分類、預后分期、治療效果的預測和個體化治療。有研究表明，miR-127-5p在多種疾病中具有重要作用，包括肝細胞癌[6]、宮頸癌[7]、乳腺癌[8]等。本研究中，筆者證明了miR-127-5p在NSCLC組織中高表達，通過比較非小細胞肺癌H358和A549細胞球形成細胞和親本細胞中miR-127-5p的表達，發現miR-127-5p在球形成細胞中顯著高表達，提示miR-127-5p可能具有腫瘤促進作用。進一步研究發現，miR-127-5p對H358和A549細胞球形成能力和侵襲能力具有正調控作用。有研究證明通過干細胞條件培養基懸浮培養可以富集腫瘤干細胞樣細胞，并且通過球形成能力的測定可以檢測腫瘤干樣細胞的自我更新能力[4]。以上結果表明miR-127-5p對非小細胞肺癌H358和A549細胞自我更新能力具有促進作用。

磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homology, PTEN)可參與細胞周期的調節，抑制腫瘤細胞的增殖、黏附、轉移、血管生成，促進細胞的凋亡、分化、衰老等多種生理和病理活動。研究表明，PTEN是最常失活的抑癌基因之一，在許多腫瘤中表達顯著降低[13]。Kuang與其同事發現miR-127-5p可靶向抑制PTEN/AKT信號通路[14]。有研究表明，PTEN/PI3K/AKT信號通路參與調節順鉑耐藥的非小細胞肺癌進展[15]。以上研究提示PTEN可能參與NSCLC的進展。本研究利用熒光素酶報告基因實驗得出了相似的結論，即miR-127-5p與PTEN存在相互作用；本研究還發現，在非小細胞肺癌A549細胞中，過表達miR-127-5p顯著下調PTEN的表達，而抑制miR-127-5p的表達則導致PTEN的表達水平增加。這提示miR-127-5p對非小細胞肺癌H358和A549細胞自我更新和侵襲能力的促進作用可能與PTEN蛋白下調有關。

綜上所述，本研究發現：1) miR-127-5p在非小細胞肺癌組織及球形成細胞中高表達；2) miR-127-5p促進非小細胞肺癌H358和A549細胞自我更新和侵襲能力；3) miR-127-5p可以靶向抑制PTEN從而發揮其腫瘤促進作用。本研究將為臨床上非小細胞肺癌的早期檢測和治療提供參考。