高效液相色譜法同時測定水產品中4種酰胺類農藥殘留

劉伶俐，徐飛良，黃向榮，索紋紋，萬譯文

(1.湖南省水產科學研究所，中國 長沙 410153；2.農業農村部漁業產品質量監督檢驗測試中心(長沙)，中國 長沙 410153；3.湖南省飼料工業辦公室，中國 長沙 410011；4.水產高效健康生產湖南省協同創新中心，中國 常德 415000)

氯蟲苯甲酰胺[1]、氟蟲雙酰胺[2]、唑蟲酰胺[3]和氟啶蟲酰胺[4]是經國家批準使用的新型、低毒、高效殺蟲劑，目前已作為甲胺磷、樂果、馬拉硫磷和甲基對硫磷等高毒有機磷農藥的替代品[5]。酰胺類殺蟲劑主要是通過作用于昆蟲體內的魚尼丁受體，促進細胞內的Ca2+失控性流失，從而高效殺死鱗翅目昆蟲，這4種新型殺蟲劑對于哺乳動物屬于低毒，但隨著產量和用量的逐年增加，很容易通過食物鏈富集在水生動物體內，富集倍數可達數萬倍，食用受污染的水產品使農藥在人體積累，達到一定程度后就會產生明顯的毒害作用，包括急性毒性、慢性毒性和“三致”毒性。因農藥不合理使用或不遵守安全間隔期規定導致的農藥殘留超標，使農藥與生態環境和食品安全之間的矛盾日益顯現[6]。為防止水產品農藥殘留嚴重危害消費者健康、影響水產業及水產貿易的發展，已經有許多針對農藥等有毒化學品的國際公約、法規及限量標準[7-11]，對保護環境、合理使用農藥、控制水產品農藥殘留起到了積極作用，而我國尚未對水產品殘留量做限定要求。

目前，關于氟啶蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺、氟蟲雙酰胺和唑蟲酰胺殘留量的檢測分析主要是對單個物質原藥、制劑或復配劑等方面的研究，且針對前兩種物質的報道比較多，后兩種的甚少；其研究主要集中在果蔬[12-14]、植物源食品[15-17]、藥材[18]、土壤[19-21]等農產品與環境樣品。現在4種物質的殘留檢測可采用ELISA快速檢測法[22]、液相色譜法[23]、液相色譜-質譜法[2-4，14]、氣相色譜法[24]、氣相色譜-質譜法[25]等。ELISA快速檢測法操作簡便，不需要大型儀器設備，對前處理的要求低，但該方法只能用于定性和半定量檢測，準確性與可靠性還需借助色譜法進行確證。液質法雖樣品用量少、靈敏度高，但因其價格昂貴、運行成本相比液相色譜高，操作要求相對也高，基層檢測單位難以配備和使用。氣相色譜或氣相色譜-質譜法僅對唑蟲酰胺的殘留檢測具有較高的精確度和靈敏度。液相色譜儀普及范圍廣，其精確度、重復性等也可滿足藥物的多殘留檢測要求。目前尚未見關于高效液相色譜法對上述4種農藥殘留同時進行分析的相關報道。基于以上，本研究采用HPLC法，試圖建立同時測定水產品中氟啶蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺、氟蟲雙酰胺和唑蟲酰胺殘留量的檢測分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters e2695高效液相色譜儀(美國，Waters公司)，配紫外檢測器(UV)；KQ-1000DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Hitachi CR22GⅢ 高速冷凍離心機(日本，Hitachi 公司)；Buchi V-300 平行蒸發儀(瑞士，Buchi公司)；N-EVAP11250氮吹濃縮裝置(美國，Organomation Associates公司)，固相萃取裝置20-Port SPE Manifold(美國，Agilent公司)；堿性氧化鋁萃取柱(200 mg/6 mL，美國Waters公司)。

氟啶蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺、氟蟲雙酰胺和唑蟲酰胺標準品(純度≥97.0%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司)，乙酸銨(色譜純，德國Fluke公司)，乙腈(色譜純，德國Merck公司)，無水硫酸鎂(MgSO4，化學純)，實驗用水符合 GB/T 6682 中一級水的標準。

1.2 分析方法

1.2.1樣品提取與凈化 準確稱取已勻質好的水產樣品5.00 g(精確至0.02 g)置于50 mL離心管內，依次加入2.00 g無水硫酸鎂、10 mL乙腈進行提取，加蓋并渦旋混勻后超聲提取8 min，6 500 r·min-1離心8 min，將上清液轉移至蒸發管或離心管中，重復提取1次，上清液合并至蒸發管或離心管中，45 ℃蒸發或氮吹至近干，加入2.00 mL乙腈渦旋溶解殘留物待凈化。將堿性氧化鋁萃取柱用4 mL乙腈活化，當溶劑液面到達柱吸附表面時，立即加入待凈化溶液，并用刻度為10 mL的離心管收集洗脫液，用2 mL乙腈沖洗蒸發管，重復沖洗2次，沖洗液一并過堿性氧化鋁萃取柱。洗脫液一并收集，于45 ℃蒸發至干，加入1.00 mL乙腈、1.00 mL流動相渦旋溶解殘渣，過0.22 μm微孔濾膜，供高效液相色譜測定。

1.2.2 色譜分析條件 高效液相色譜柱(4.6 mm×250 mm，Waters Atlantis T3)，檢測波長為265 nm，流動相為乙腈-0.1 mol·L-1乙酸銨緩沖溶液體系，等度洗脫，流速0.8 mL·min-1，進樣量20 μL，柱溫為35 ℃。

1.2.3 標準溶液配制及標準曲線的繪制 準確稱取適量氟啶蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺、氟蟲雙酰胺和唑蟲酰胺標準品，用乙腈溶解稀釋并定容至50 mL，配制成100 mg·L-1的標準儲備液，儲備液于-18 ℃保存，有效期為6個月。分別取適量標準儲備液，用乙腈配制成質量濃度分別為0.05，0.1，0.5，1.0，5.0 mg·L-1的系列標準工作液，現配現用。以標準溶液質量濃度(x)與目標峰面積(y)繪制標準曲線。

1.2.4 添加回收實驗 分別在水產品空白樣品中添加氟啶蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺和氟蟲雙酰胺標準溶液，添加后質量分數分別為0.1，0.5，1.0 μg·g-1；分別在水產品空白樣品中添加唑蟲酰胺標準溶液，添加后質量分數分別為0.2，1.0，2.0 μg·g-1。每個處理6次重復，計算平均添加回收率和相對標準偏差(RSD)。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

氟啶蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺、氟蟲雙酰胺和唑蟲酰胺中氟啶蟲酰胺極性較大，而其他3種的極性較弱，參考已有文獻資料[15-17]，以乙腈、甲醇、0.1%甲酸化乙腈、乙酸乙酯與丙酮混合液(體積比為95∶5)作為提取劑對水產品中以上4種酰胺類物質進行提取分離試驗，結果見圖1。結果顯示，乙腈提取的4種物質的回收率均在75%以上，其提取能力強，不易提取出水產品基質中的多余雜質，能減少提取液中的干擾成分，有利于后續的凈化；甲醇提取唑蟲酰胺時受基質干擾特別大，未能進行有效提取，不符合實驗要求；0.1%甲酸化乙腈提取的4種物質的回收率雖在70%以上，但唑蟲酰胺的目標峰因受附近雜峰的干擾，嚴重影響了分離效果與峰型；乙酸乙酯與丙酮混合液(體積比為95∶5)提取氟啶蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺和氟蟲雙酰胺的回收率均低于50%，雜質干擾較大。從提取分離效果、峰型及回收率等方面綜合考慮，本文選用廣泛使用并具有沉淀蛋白作用的乙腈作為水產品的提取劑，能將目標成分與雜質有效分離，峰型尖銳，基線穩定，分離時間適中。

圖1 水產品中4種提取劑的提取效果色譜圖

2.2 凈化方法的選擇

水產品由于基質成分比較復雜，且色素及脂類物質較多，可能對色譜分離效果及儀器靈敏度造成一定程度的影響，故需對樣品進行凈化，以滿足儀器和實驗要求[26]。目前，水產品的凈化多選用固相萃取的方式，該技術具有易操作、溶劑用量少等優點。本文選用氨基酸柱[27]、中性氧化鋁柱[28]和堿性氧化鋁柱[23]3種固相萃取柱進行凈化效果的對比實驗，結果見圖2。結果表明，經過氨基酸柱凈化后，唑蟲酰胺出現回收率偏低的現象，這可能是由于唑蟲酰胺中—NH官能團與氨基發生鍵合；用中性氧化鋁柱凈化后，氟蟲雙酰胺未能與雜質完全分離，峰型不好；堿性氧化鋁柱凈化結果雜質干擾較小、目標物分離效果好、峰型對稱，能滿足實驗要求。本文最終選用堿性氧化鋁柱作為固相萃取凈化柱。

圖2 水產品中3種固相萃取柱的凈化效果色譜圖

2.3 色譜條件的優化

圖3 4種物質標準溶液

甲醇和乙腈是檢測水產品中農藥殘留最常用的兩種有機系流動相。筆者對比甲醇和乙腈試驗后得到與文獻[15，23]相同的結果，即以乙腈為流動相時分離效果較好、儀器靈敏度較高，再添加一定濃度的乙酸銨，其峰型更好。結合4種目標物的化學性質及本試驗分析要求，流動相選用乙腈-0.1 mol·L-1乙酸銨緩沖溶液體系，分別對流動相體積比90∶10，80∶20，70∶30及60∶40進行比較試驗，檢測標準溶液及試樣的分離效果。結果表明：乙腈-0.1 mol·L-1乙酸銨緩沖溶液體積比為60∶40時，4種物質分離較好，且出峰時間均在15 min內，能滿足樣品檢測的需要，見圖3。

2.4 線性曲線、相關性及檢出限

在上述色譜操作條件下，將配制好的氟啶蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺、氟蟲雙酰胺和唑蟲酰胺標準工作液(見1.2.3)依次進行測定，計算得出其線性回歸方程及相關系數；以3倍信噪比(S/N)為檢出限(LOD)，10倍信噪比(S/N)為定量限(LOQ)，計算得出其LOD和LOQ值，結果見表1。在優化條件下，4種酰胺類的線性范圍均為0.05～5.0 mg·L-1，線性相關系數均不低于0.999 9。氟啶蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺和氟蟲雙酰胺的檢出限均為0.1 μg·g-1，唑蟲酰胺為0.2 μg·g-1，表明該方法在測定范圍內線性相關性很好。

表1 4種酰胺類殺蟲劑的線性回歸方程、相關系數、檢出限及定量限

2.5 方法準確度與精密度試驗

在水產品基質中加入定量的氟啶蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺、氟蟲雙酰胺和唑蟲酰胺標準溶液，氟啶蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺和氟蟲雙酰胺添加到0.1～1.0 μg·g-1，唑蟲酰胺添加到0.2～2.0 μg·g-1，每個添加水平做6次平行實驗，按1.2所述方法處理后高效液相色譜儀分析測定，計算加標回收率及相對標準偏差(RSD)。由表2可知，水產品中氟啶蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺和氟蟲雙酰胺在0.1，0.5，1.0 μg·g-1時的回收率為99.5%～110.5%，RSD值為1.53%～3.93%；唑蟲酰胺在0.2，1.0，2.0 μg·g-1時的回收率為93.7%～109.4%，RSD值為0.83%～3.14%，能滿足實驗及分析要求。

表2 方法準確度與精密度試驗結果(n=6)

2.6 實際樣品的測定

利用本文建立的方法，隨機抽取市場中 30 批次的水產品進行分析檢測，樣品均未檢出氟啶蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺、氟蟲雙酰胺和唑蟲酰胺。在室內養殖水體(提前一周注入進行曝氣處理)中加入濃度為5%的4種物質的混合制劑，試驗魚來自湖南省水產原種場，將其暫養一周后選取健康、體格較為一致的40條進行正式的養殖試驗，試驗為期25天。養殖試驗結束時用ELISA快速檢測法進行篩查，其中1份樣品檢出氯蟲苯甲酰胺，1份樣品檢出唑蟲酰胺，將此2份陽性樣品用本方法和氣相色譜法進行檢測分析比較，結果見表3。

表3 3種分析方法結果對比

由表3可知，ELISA快速檢測法雖然操作簡單、對前處理的要求低，但僅限于定性檢測。因氯蟲苯甲酰胺不易氣化，故用氣相色譜法無法檢出。本法經過提取凈化及色譜條件的優化后，可以同時進行4種物質的測定，且檢出限低、靈敏度高，具有很好的適用性和可操作性。

3 結論

本文首次建立了同時測定水產品中氟啶蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺、氟蟲雙酰胺及唑蟲酰胺殘留量的高效液相色譜(HPLC)檢測方法。該方法線性關系良好、操作簡便，并具有定量準確、重復性好、分析速度快及精密度高等特點，滿足水產品中氟啶蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺、氟蟲雙酰胺和唑蟲酰胺殘留量同時分析測定的要求。