土家藥冬古子總皂苷提取工藝優(yōu)化及體外抑菌活性研究

馬金虎，侯娟，何洪，李益燦，黃春瀅，孫雯婷

（湖南吉首大學(xué)，湖南吉首416000）

經(jīng)過(guò)查閱大量文獻(xiàn)，我們對(duì)湘西土家藥冬古子中總皂苷類(lèi)物質(zhì)提取工藝優(yōu)化及體外抑菌活性研究的方法有了一些大致的了解。總皂苷是苷元為三萜或螺旋甾烷類(lèi)的一類(lèi)較復(fù)雜的糖苷類(lèi)化合物，廣泛存在于中草藥中[1]。本項(xiàng)提取方法快速、有效，研究方法簡(jiǎn)便、及時(shí)、可靠，優(yōu)化改良提取方法，為冬古子果實(shí)的綜合利用提供理論支持，從天然植物藥材中提取純化物質(zhì)總皂苷，其醫(yī)藥、保健功能有效且毒副作用與人工合成品相比較小,發(fā)展前景廣闊具有帶動(dòng)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)及醫(yī)藥保健行業(yè)發(fā)展效應(yīng)。土家藥冬古子果實(shí)的本草學(xué)研究雖有一定成果，但對(duì)其活性成分的抑菌效果以及比較方面缺乏深入研究，故未形成冬古子果實(shí)在抑菌醫(yī)藥方面的研究?jī)r(jià)值和可靠的理論支持，利用湘西具有得天獨(dú)厚的野生藥冬古子資源，采用冷凝回流提取法，乙醇提取法（采用濃度、時(shí)間、溫度梯度、料液比）、丙酮提取法來(lái)提取冬古子果實(shí)中的總皂苷來(lái)研究工藝優(yōu)化及體外抑菌活性，完成本次課題。本項(xiàng)以土家族藥材冬古子果實(shí)提取總皂苷為研究對(duì)象，采用乙醇提取法來(lái)提取冬古子果實(shí)中總皂苷的有效活性物質(zhì)；并使用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面法優(yōu)化冬古子果實(shí)提取方案；為冬古子果實(shí)的綜合利用提供理論支持，促進(jìn)抑菌藥物的研究發(fā)展，為今后抑菌類(lèi)有效活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用提供有價(jià)值的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試藥

購(gòu)買(mǎi)土家藥冬古子，經(jīng)鑒定和《中國(guó)藥典》冬古子藥材向下規(guī)定相符[2]。

1.2 儀器

采用天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)的高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，上海黃海藥檢儀器有限公司生產(chǎn)的電熱恒溫水浴鍋，保定高新區(qū)陽(yáng)光科教儀器廠生產(chǎn)的紫外分光光度計(jì)（UV751GD）、數(shù)控超聲波清洗器（KQ5200DE型）、循環(huán)水式多用真空泵（SHD-Ⅲ型），上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的電熱鼓風(fēng)干燥箱（101-2型），日本島津公司生產(chǎn)的液相色譜儀（LC-10Atvp型）。

1.3 方法

1）冬古子中總皂苷的提取。將新鮮冬古子樣品洗凈，切斷，于40～60℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干，用粉碎機(jī)粉碎并過(guò)50目篩，密封保存?zhèn)溆谩７Q(chēng)取一定量的冬古子粉末，研究不同提取時(shí)間、提取溫度、料液比以及乙醇濃度等試驗(yàn)條件對(duì)冬古子總皂苷提取率的影響。精密稱(chēng)取一定質(zhì)量的冬古子粉末，置于圓底燒瓶中，加入一定濃度的乙醇適量，在一定的水浴條件下進(jìn)行回流提取，離心過(guò)濾。將粗提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，干燥至恒重。提取率計(jì)算公式如下：提取率/%=冬古子粗提物中總皂苷重量/冬古子原料總重量×100。

2）響應(yīng)面法優(yōu)化冬古子中皂苷提取工藝。根據(jù)Design-Expert8.0中Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、料液比4個(gè)因素分別以A、B、C、D表示，每一個(gè)自變量的低、中、高試驗(yàn)水平分別以-1，0，1進(jìn)行編碼，以皂苷提取率（Y）為響應(yīng)值。試驗(yàn)因素及水平編碼見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素及水平編碼

3）冬古子中總皂苷物質(zhì)的提取——乙醇提取法。①乙醇濃度對(duì)總皂苷提取率的影響。取冬古子果實(shí)粉末1 g，分別加入不同濃度的乙醇溶液55%、75%、95%，液料比為20∶1（g/mL），超聲提取時(shí)間3 min，按2.1步驟測(cè)定吸光度，每組做3個(gè)平行試驗(yàn)；②提取時(shí)間對(duì)總皂苷提取率的影響。取冬古子果實(shí)粉末1 g，分別提取15、25、35min，以75%濃度乙醇為提取劑，液料比為20∶1（mL/g）。按2.1步驟測(cè)定吸光度，每組做3個(gè)平行試驗(yàn)；③提取溫度對(duì)總皂苷提取率的影響。取冬古子果實(shí)粉末1 g，分別提取20、40、60℃，以75%濃度乙醇為提取劑，液料比為20∶1（mL/g）。按2.1步驟測(cè)定吸光度，每組做3個(gè)平行試驗(yàn)；④液料比對(duì)總皂苷提取率的影響。取冬古子果實(shí)粉末1 g，分別用不同的液料比10∶1、20∶1、30∶1（mL/g），以75%濃度乙醇為提取劑，用超聲提取35 min。按2.1步驟測(cè)定吸光度，每組做3個(gè)平行試驗(yàn)。

4）生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。選取抑菌實(shí)驗(yàn)效果最明顯的菌種作為供試菌，研究抑菌效果最顯著的提取物對(duì)該菌生長(zhǎng)的影響，生長(zhǎng)曲線的測(cè)定參考王巍[3]的方法并略作修改。

5）冬古子總皂苷提取液抑菌效果測(cè)定。采用無(wú)菌藥敏試紙擴(kuò)散法，通過(guò)抑菌環(huán)的直徑大小來(lái)判斷冬古子總皂苷提取液對(duì)金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌、枯草桿菌、大腸桿菌4種菌的是否有抑菌效果，并且判斷對(duì)這四種菌的抑制強(qiáng)弱。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)及工業(yè)優(yōu)化得出最佳提取條件，然后在這一提取條件下的同一濃度對(duì)金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌、枯草桿菌、大腸桿菌4種菌的抑菌效果進(jìn)行評(píng)定，取出對(duì)哪種抑菌效果最好。具體操作為：

①藥敏試紙的制備：在無(wú)菌條件下，將無(wú)菌藥敏試紙分別浸泡在3.125mg/mL總皂苷提取液和無(wú)菌水中15min，然后用無(wú)菌鑷子將浸泡好的藥敏試紙放置在盤(pán)中備用。

②培養(yǎng)基的制備：無(wú)菌條件下，用15cm培養(yǎng)皿，平均劃分四個(gè)區(qū)域并在固定的位置做好相應(yīng)的編號(hào)A～D，

將普通營(yíng)養(yǎng)在45～55℃倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿當(dāng)中，等到其凝固之后在四個(gè)區(qū)域分別接入金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌、枯草桿菌、大腸桿菌4種菌，將已制備好的藥敏試紙分別放入培養(yǎng)基的四個(gè)區(qū)域中，每種菌三份，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，然后在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h。最后對(duì)抑菌環(huán)直徑測(cè)量三次，取平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

1）乙醇濃度對(duì)冬古子總皂苷提取率的影響。將冬古子粉末稱(chēng)取出來(lái)，將提取溫度、料液比設(shè)定為60℃、1∶20（g/mL），分別用55%、75%、95%的乙醇提取35min，結(jié)果表明，溶劑最好為55%乙醇。

2）料液比對(duì)冬古子總皂苷提取率的影響。將冬古子粉末稱(chēng)取出來(lái)，將提取溫度、乙醇濃度分別設(shè)定為60℃、75%，分別以蘆筍粉末質(zhì)量：乙醇溶液體積1∶10、1∶20、1∶30（g/mL）的料液比提取35min，結(jié)果表明，料液比最好為1∶20。

3）提取溫度對(duì)冬古子總皂苷提取率的影響。將冬古子粉末稱(chēng)取出來(lái)，將料液比、乙醇濃度分別設(shè)定為1∶20（g/mL）、75%，分別在20℃、40℃、60℃溫度下提取35min，結(jié)果表明，提取溫度最好為60℃。

4）提取時(shí)間對(duì)冬古子總皂苷提取率的影響。將冬古子粉末稱(chēng)取出來(lái)，將溫度、料液比、乙醇濃度分別設(shè)定為60℃、1∶20（g/mL）、75%，分別提取15min、25min、35min，結(jié)果表明，提取時(shí)間最好為35min。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

為研究四個(gè)因素對(duì)冬古子總皂苷的提取率的影響特安排四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2和表3。結(jié)果分析:方差分析選出最佳提取方案，實(shí)驗(yàn)1、2、3、4、5、6、7、8、9的MIC值分 別 為 12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.125mg/mL、6.25mg/mL、12.5mg/mL、12.5mg/mL、25mg/mL、25mg/mL、50mg/mL。因此實(shí)驗(yàn)3為最佳提取方案。

表2 試驗(yàn)因素與水平

表3 實(shí)驗(yàn)計(jì)劃表

2.3 冬古子總皂苷提取液對(duì)四種致病菌抑菌效果

通過(guò)比較抑菌環(huán)得出：3.125mg/mL的冬古子總皂苷提液對(duì)四種菌均有抑菌環(huán)的出現(xiàn)，并且抑菌環(huán)明顯，通過(guò)對(duì)抑菌環(huán)直徑大小測(cè)量結(jié)果可知：冬古子總皂苷提取液對(duì)大腸桿菌的抑菌抑菌效果最為明顯。

3 討論與結(jié)論

當(dāng)今社會(huì)對(duì)抑菌類(lèi)藥物需求量大，發(fā)掘土家藥冬古子提取物新活性,拓寬其應(yīng)用范圍。冬古子別名為瓜蔞，栝樓屬Trichosanthes L，生于向陽(yáng)山坡林下、灌叢中、草地和村旁田邊。在秋冬時(shí)取材于成熟的果實(shí)，懸掛通風(fēng)干燥處晾干。冬古子含有三萜皂苷、有機(jī)酸、黃酮、皂苷、生物堿、糖類(lèi)及色素等藥理活性成分。其中，皂苷是苷元為三萜或螺旋甾烷類(lèi)的一類(lèi)較復(fù)雜的糖苷類(lèi)化合物，廣泛存在于中草藥中[3]。現(xiàn)有研究表明[4]，皂苷具有抗菌、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎抗癌等生物活性。近幾年國(guó)內(nèi)外學(xué)者很少有針對(duì)冬古子中皂苷藥理活性的研究，為深入研究冬古子中總皂苷的抑菌活性及其最優(yōu)提取方案，采用冷凝回流提取法，乙醇提取法（采用濃度、時(shí)間、溫度梯度）、丙酮提取法分別來(lái)提取冬古子果實(shí)中的總皂苷，再以四種常見(jiàn)菌（大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌及乙型鏈球菌）作為實(shí)驗(yàn)菌進(jìn)行藥物敏感實(shí)驗(yàn)，并得出冬古子總皂苷的最佳抑菌濃度。

冬古子籽、冬古子皮、果實(shí)等的主要化學(xué)成分有脂肪酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、常見(jiàn)的微量元素等，但各自的比例不同，因此藥理作用也是稍有差別[5]。冬古子制品可用于治療咳嗽、胸悶等癥狀[6]。有研究發(fā)現(xiàn)地子匯總的揮發(fā)性油脂對(duì)癌細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒活性，冬古子子油具有降血糖以及改善糖耐量的作用[7]，此外，研究表明冬古子提取物具有抗肺纖維化、抗HIV活性等作用[8]。本研究結(jié)果表明，單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，提取冬古子總皂苷過(guò)程中溶劑最好為55%乙醇，料液比最好為1∶30，提取溫度最好為60℃，提取時(shí)間最好為35min。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：方差分析選出最佳提取方案，實(shí)驗(yàn)1、2、3、4、5、6、7、8、9的MIC值分別為12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.125mg/mL、6.25mg/mL、12.5mg/mL、12.5mg/mL、25mg/mL、25mg/mL、50mg/mL。因此實(shí)驗(yàn)3為最佳提取方案，和上述研究結(jié)果一致。

綜上所述，土家藥冬古子總皂苷提取工藝優(yōu)化能夠有效改善其體外抑菌活性，值得推廣。