新型抗前列腺癌藥物ODM-201的研究進展

黃晨超，包旗旗，張榮玉，周金明

(浙江師范大學化學與生命科學學院&現代制藥創新研究中心,浙江 金華 321004)

前列腺癌是最常見的男性泌尿系統惡性腫瘤，病情發展緩慢，早期可以治愈，但是癥狀不明顯，不易發現。晚期以保守治療，延長患者生存期，維持生活質量為主。研究表明，2018年全球范圍內，男性惡性腫瘤中前列腺癌發病率第二[1]，有130萬新發病例和36萬死亡病例。我國前列腺癌的發病率相對較低，但受各方條件影響約束，大部分中國患者就診時即處于晚期，且近十年來發病率也是逐年升高。

早在1941年，人們就發現通過手術去勢或者使用雌激素治療可以緩解晚期前列腺癌的癥狀。雄激素信號通路在前列腺癌的發生和發展中起到了重要作用[2]，雄激素受體(androgen receptor,AR)是治療前列腺癌最重要的靶點。80%以上的前列腺癌都是雄激素依賴性的，因而雄激素剝奪療法(ADT)已成為前列腺癌男性患者全身性治療的基礎，在診斷后的第一年中，有44.8%的患者接受ADT，而在74歲以上且患有高級組織學指標診斷為T1、T2腫瘤的男性中，或患有T3、T4腫瘤的，這一比例增加到48.7%[3-7]。在病情前期，可以通過這種療法有效控制病情。然而最終大部分患者的病情在經過中位時間18～24個月的緩和后，都會發展到受一種或多種抵抗機制驅動的去勢抵抗性階段[8-10]，被稱為去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)。

1 去勢抵抗性前列腺癌及其治療手段

根據2016年歐洲泌尿外科協會指南的標準[11]，CRPC確診需要同時滿足兩個條件：①血清睪酮達到去勢水平(<1.7 mmol·L-1)；②間隔一周，前列腺特異性抗原(prostate specific antigen,PSA)水平連續3次上調，且對較于最低值，升高超過50%，PSA>2 ng·mL-1，或者骨掃描發現2個及以上的新病灶或符合實體腫瘤評價標準的軟組織病灶增大。

去勢抵抗性前列腺癌發生機制最為常見的有3類。一是基因擴增[12]和過表達[13-15]導致AR的表達水平升高，對于腎上腺素來源與前列腺癌細胞自身合成的少量雄激素異常敏感[16-17]。二是基因突變產生AR突變體及可變剪接體。部分突變使得AR的激活不再局限于結合雄激素[12]，失去了特異選擇性。雌激素、糖皮質激素和孕激素等都可以與AR結合，促進前列腺癌細胞的生長；另一部分突變體可以使拮抗劑轉化為激動劑[18]，第一代抗雄激素藥物尼魯米特和氟他胺與T878A和H875Y結合后，反而使AR轉為激動構象，AR信號通路被激活。另外一些AR可變剪接體由于缺少配體結合域，不需要結合雄激素就可以進入核內，發揮AR的調控功能，因而促進了去勢抵抗的形成[19-21]。三是在AR信號通路上繞開AR進行信號傳遞或者完全不依賴于AR信號通路激活下游信號。糖皮質激素受體、黃體酮受體等同屬于甾體核受體，在DNA結合域上和AR具有一定的相似性。這些受體蛋白的上調，可以補償性激活AR下游信號通路，調控AR靶基因的表達[22-25]。除了AR信號通路外，Stat3信號通路的激活[26]或抗凋亡蛋白Bcl-2的上調[27]等都可以使前列腺癌細胞在缺少雄激素的情況下生長、增殖。

根據這些研究，我們不難發現，即使病情發展為CRPC，AR仍然可以作為前列腺癌治療的重要靶點[28]。目前，CRPC的治療藥物主要有化療藥物，免疫抑制劑，放射劑，雄激素合成抑制劑和雄激素受體抑制劑等[29-32]。在用藥階段，需要綜合考慮不同患者群體最適合的新藥，CRPC患者的最佳給藥時間和給藥順序，評估和確定新老藥物聯合使用的最佳組合，克服藥物的耐藥性等等問題。因此不斷地研發新藥，根據病人的具體情況聯用用藥，盡量延長病人的生存期，減輕痛苦是前列腺癌治療不變的主題。目前正在研發的CRPC藥物中主要方向是CYP17A1抑制劑及AR拮抗劑。

2 ODM-201的研究進展

由于AR信號通路對前列腺癌的重要意義，新型AR拮抗劑研發已成為抗前列腺癌藥物研究的熱點。二代AR拮抗劑相較于上一代，克服了一代拮抗劑引起的突變耐藥性(如T878A會引起氟他胺耐藥，而W742C會引起比卡魯胺耐藥)，降低了不良反應的等級和發生頻率，同時對AR的親和性也有明顯的提升。ODM-201(Darolutamide，BAY-1841788，NUBEQA)是拜耳與Orion聯合推出的抗前列腺癌新藥，是最新(2019年)通過美國食品藥品監督管理局(FDA)批準的二代AR拮抗劑，用于非轉移性去勢抵抗性前列腺癌(non-metastatic castration resistant prostate cancer，nmCRPC)的治療[33]。它與目前已有的AR拮抗劑在結構上有著明顯的不同(見圖1)，在結合AR的親和力以及抗腫瘤活性等方面都有不俗的表現。

圖1 一代、二代抗雄激素藥物及ODM-201與其主要代謝物的結構

2.1 ODM-201結構及作用機理 ODM-201因其獨特的化學結構而對AR具有很強的親和力和拮抗活性，從而抑制了AR的功能和前列腺癌細胞的生長[34]。ODM-201化學名稱為N-((S)-2-(3-(3-氯-4-氰基苯基)-1H-吡唑-1-基)-1-甲基乙基)-5-(1-羥基乙基)-1H-吡唑-甲酰胺。其中吡唑環上羥乙基具有兩種構象，ODM-201為消旋化合物，同時具有(S，R)和(S，S)兩種構象。體外和體內實驗均證實了化合物是通過主要的循環代謝物ORM-15341實現這兩個非對映異構體的快速轉換(見圖1)[34-35]。因此，兩種異構體的拮抗作用基本相同，在合成時不需要額外選擇手性合成。此外，盡管在高劑量下非對映異構體比例保持不變，但觀察到的兩種非對映異構體的藥動學參數(PK parameter)略有不同，(S，R)構象的ODM-201可以更快地被代謝。

AR存在于細胞質內時與熱休克蛋白結合，當雄激素與AR LBD域上的配體結合口袋結合后，誘導AR轉變為激活構象，釋放熱休克蛋白形成二聚體。AR二聚體被轉運進入細胞核內，與DNA上的特異應答元件作用，促進AR下游信號傳遞，從而促進細胞的生長與增殖。二代AR拮抗劑憑借與AR的高親和性，競爭性地結合AR且使其不能被激活，進而阻斷雄激素誘導的AR核易位。ODM-201的Ki值和IC50值分別為11和26 nmol·L-1，相較于恩雜魯胺(86、219 nmol·L-1)和阿帕米特(93、200 nmol·L-1)，具有明顯的優勢，同時其具有更加良好的體外抗細胞增殖活性及體內抗腫瘤活性[34]。2020年，拜耳針對ODM-201的作用機理進行的研究認為，ODM-201憑借對AR的高親和力耗盡了AR基因調節區域，并且阻斷了AR驅動的轉錄信號傳導。根據評估H3K27ac、H3K4me1、FOXA1和BRD4的結合情況，推斷增強子和超級增強子的激活在染色質水平被阻斷，從而降低了幾種重要的前列腺癌細胞增殖的下游途徑，例如AR信號，脂肪酸代謝，未折疊的蛋白質反應以及PI3K/AKT/MTOR途徑[36]。

除此之外，ODM-201較為獨特的一點是，針對恩雜魯胺和阿帕米特耐藥的單突變體AR(F877L)，恩雜魯胺耐藥的雙突變體AR(H875Y/T878A)、AR(F877L/T878A)以及比卡魯胺和氫化氟他胺耐藥的AR(W742L)和 AR(T878A)都具有完全的拮抗作用。同時還有研究表明ODM-201顯著抑制以前未報道過的比卡魯胺和氟他胺耐藥的突變體AR(T878G)的轉錄活性[34，37-38]。另外值得注意的是，ODM-201是唯一結合T878G突變體口袋卻沒有在高濃度下部分激活該AR突變體的藥物[38]。對于這些突變體的抑制證明了ODM-201具有克服臨床治療中耐藥性的潛力。

2.2 ODM-201的臨床試驗 ODM-201的ARADES(NCT01317641)和ARAFOR(NCT01784757)Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗先后就ODM-201的長期服用安全性，耐受性和抗腫瘤活性進行了研究[39-40]，結果均表明CRPC患者對于ODM-201的耐受度高，不良反應等級低，大多數不良事件為1-2級，并且不同劑量水平之間的不良事件特征沒有差異。最常出現的不良反應(adverse events，ADs)，如疲勞，腹瀉，食欲下降，惡心等都被認為與疾病本身有關，而非藥物引起。之前已有小鼠實驗表明，口服 7 d后，ODM-201的血腦滲透率為1.9%～3.9%，而其他二代抗雄激素藥物恩雜魯胺和阿帕米特分別是27%和62%[34]。兩次臨床試驗中均證實了這一點，ODM-201所誘發的如癲癇等中樞神經方面的副反應幾乎可以忽略不計。ODM-201抗腫瘤活性強，在所有劑量和所有治療分層亞組中均觀察到PSA降低至少50%[39]。在總體人群中沒有記錄到明顯的劑量依賴性活性，但是每天1 400 mg的劑量在先前未接受過化學療法或CYP17抑制劑治療的患者中產生的PSA響應率(PSA降低50%及以上的比率)最高，接受過CYP17抑制劑的患者最低[39]。這些數據與恩雜魯胺和CYP17抑制劑相繼治療去勢抵抗性前列腺癌中的交叉耐藥性報道相符。試驗結果還表明片劑和膠囊具有相似的藥代動力學。但進食狀態下，吸收率比禁食高兩倍，表明與食物一起服用的片劑可以減輕患者的用藥負擔[40]。但是在2017年，日本國立癌癥研究中心東醫院就黃種人補充了ODM-201 Ⅰ期用藥數據[41]，由于試驗條件控制不嚴，觀察到的PSA響應率不算樂觀，9名患者中僅1名在第12周PSA下降了50%以上。

ODM-201的ARAMIS Ⅲ期(NCT02200614)針對目前正在接受雄激素剝奪療法治療且疾病轉移風險高的1 509名nmCRPC患者，評估了ODM-201的安全性和有效性[42-43]。根據試驗結果，ODM-201可以顯著延長中位無轉移生存期。相較于安慰組，ODM-201組患者的中位無轉移生存期延長了22個月[42]。ODM-201組和安慰劑組的3年總生存率分別為83%和77%。ODM-201組患者死亡或轉移風險較安慰劑組顯著降低59%[43]。最新公布的95名患者參與的日本亞組臨床數據雖然在主要終點上未達到目標，但其余數據趨勢均與總體保持一致，耐受性良好[44]。

2.3 ODM-201耐藥的潛在機制 目前并沒有明確針對ODM-201的耐藥性研究報告，但2020年，Morsy等[45]研究發現，ODM-201可以在前列腺癌的體外模型中誘導AKR1C3(醛糖酮還原酶1C3)表達，并且對AKR1C3介導的耐藥性敏感。AKR1C3參與內源性雄激素的合成，在前列腺癌細胞中高度表達會產生去勢抵抗。研究人員用ODM-201處理AKR1C3不表達，正常表達和過表達的3種細胞系，得到IC50值與AKR1C3表達水平呈現正相關的結果。而耐藥細胞經過高選擇性的AKR1C3抑制劑KV-49g處理后，又重新對ODM-201恢復活性。由此推斷AKR1C3過表達很有可能是ODM-201的潛在耐藥機制，可以通過聯合用藥克服。

AKR1C3過表達已經被證明是恩雜魯胺/阿比特龍耐藥性的關鍵機制[46-48]。此外，目前包括ODM-201在內的二代AR拮抗劑都無法靶向AR-V7可變剪接體，因此臨床上認為AR-V7在恩雜魯胺耐藥機制中也起著重要作用。有研究表明AKR1C3可以通過泛素-蛋白酶體系統調節和穩定全長AR和AR-V7可變剪接體[46]。這表明AKR1C3/AR-V7軸在恩雜魯胺和阿比特龍的耐藥中起關鍵作用。對于恩雜魯胺/阿比特龍耐藥細胞，ODM-201具有交叉耐藥性。但是通過敲除或者靶向耐藥細胞中的AKR1C3蛋白可以顯著下調全長AR、AR-V7、c-Myc的表達，使耐藥細胞對ODM-201重新敏感。然而敲除或者靶向AR-V7可變剪切體只會下調c-Myc，而不影響AKR1C3的表達[49]，癌細胞對于ODM-201仍然具有耐藥性。

2.4 ODM-201的合成工藝研究 在ODM-201通過了FDA批準后，整個藥物和藥品開發計劃都將由Orion執行。Orion公司優化了重要的工藝開發提高了收率，通過結晶進行了流水線分離，并盡量避免了不經濟的試劑，但根據數項披露的專利，可知ODM-201的合成途徑仍未改變[50]。Orion公司設計和開發的ODM-201的最新合成路線如圖2所示。

圖2 Orion公司公布的合成路線

ODM-201是非對映異構體的混合物。兩種單一構象的化合物可以根據專利WO 2016/1230530 A1進行合成[51]，如圖3A所示。其中關鍵手性中間體10、11可分別通過KRED酶(酮還原酶)催化得到，或者通過化合物12和手性化合物13或14在催化劑下分別制備得到[51]。

圖3 ODM-201手性合成工藝

上述手性合成的方法中，酶還原不適合應用于工業生產。后者反應收率極低，僅為0.026%。因此2017年，Pan等[52]利用分子內1,3-偶極環加成反應開發了一種高效合成手性ODM-201的方法。將化合物20手性吡唑環羧酸乙酯的產率大大提高，但由于反應路線略顯冗長，8步反應總收率為0.4%～0.7%。目前更為簡便，合理，適用于工業生產ODM-201的方法還有待開發。

2.5 基于ODM-201的結構優化 到目前為止，針對ODM-201結構優化方面的研究還很少。2019年，四川大學的Yu等[53]針對ODM-201的結構進行優化，以期獲得抗腫瘤活性更好的抗雄激素藥物前體，得到了一批針對野生型AR和AR突變體的雙功能(下調劑，抑制劑)ODM-201類似物，同時選出了能夠克服CRPC耐藥性，有效且口服可用的先導化合物4k。

圖4 ODM-201及其類似物4k、4b的化學結構

將ODM-201結構簡單分為4個部分，A、B、D環和C鏈，主要針對D環和C鏈進行了改造。根據表1中數據顯示，ODM-201及ORM-15341在VCaP細胞系中濃度增大到一定程度抑制作用反而減弱。用不同取代基的苯基或烷基取代D環上的吡唑環部分，所合成的化合物在VCaP細胞系變為濃度依賴性抑制，說明針對D環部分的改造是有意義的。結構上應當保留芳香環，且芳香環上取代基的影響巨大。苯環間位取代相比對位活性更強。去掉C鏈上的羰基，并在D環處引入了各種苯環，芳香雜環，芳香族二環，絕大部分化合物表現出良好至優異的活性，同時部分化合物對于表達AR-V7的22Rv1細胞系表現出了抑制活性，IC50值降低至亞微摩爾范圍。證明羰基可以消除，芳香環對于活性起到正向作用，且雜環活性大部分高于苯環，氮的個數和取代位點對于活性影響極大，但是具體的影響機理從目前的數據中還無法判斷。

表1 部分化合物的體外抗細胞增殖活性[53]

最終發現，連接喹啉(4b)和嘌呤(4k)基團的化合物對AR過表達的VCaP細胞和AR-V7陽性22Rv1細胞的抗增殖活性優于ODM-201和恩雜魯胺。篩選包括4b、4k在內活性尚可的化合物進入下一步研究，發現這些化合物基本上都能在mRNA水平下調AR的表達，其中4b和4k仍然是下調效果最佳的。4k和4b對于全長AR、AR-V7、AR-F876L突變體有抑制和下調作用，4k在體內半衰期比較短，但是有更高的最大血漿濃度(2 648.88 ng·mL-1)和全身暴露(AUC0～t值為7 280.76 ·h·mL-1)[53]，因此用于動物實驗，結果表明4k的抗腫瘤活性優于恩雜魯胺，在治療期間未觀察到明顯的體重減輕。

3 總結與展望

ODM-201作為一個全新結構的AR拮抗劑，對于多種AR突變體具有抑制作用，具有在臨床治療中克服耐藥的潛力，能夠顯著抑制腫瘤增長，不會透過血腦屏障，產生中樞神經方面的不良反應。臨床試驗證明它能夠顯著延長nmCRPC患者的中位無轉移生存期，目前還未產生耐藥，建議在病情發展早期ADT聯合ODM-201進行治療。雖然ODM-201已經通過了FDA批準，由公司進行生產和銷售，但是其工業化生產的合成路線仍然值得進一步優化。由于ODM-201結構獨特，目前也沒有大量研究對其進行優化，因此構效關系不夠明確，只能確定維持C鏈的S構象，丙胺基對于藥物活性有利，D環上氮雜環優于苯環，氮的個數和位置影響極大，但具體如何影響尚不明確。

目前ODM-201上市最大的困難應該是與恩雜魯胺競爭市場份額。同時隨著藥物上市后更多的臨床數據，可能會出現延遲和罕見的不良反應，需要對ODM-201研究的進一步深入以及結構優化以期得到效果更好的抗雄激素藥物。