超聲響應性納米粒子用于超聲/光聲成像引導下聲動力/饑餓治療小鼠結直腸癌

徐 偉，李 洋，顧海濤，張劍波，王志剛，王繼見*

(1.重慶醫科大學附屬第二醫院胃腸外科，2.超聲科，重慶 400010；3.重慶醫科大學超聲影像學研究所 重慶市重點實驗室，重慶 400010)

聲動力治療(sonodynamic therapy， SDT)無創、操作簡便、超聲穿透范圍深并可定點靶向輻照，廣泛用于治療腫瘤[1]，但腫瘤的異質性和復雜性使單一治療方式無法達到根治效果[2]。通過阻斷營養供應使腫瘤細胞處于饑餓狀態成為抗腫瘤治療的潛在策略[3]。隨著精準醫療理念的提出，可視化治療成為目前研究熱點[4]。多模態成像可更加全面地獲取腫瘤影像學信息[5]。本研究將卟啉鋅(zinc porphyrin, TPZ)聲敏劑和葡萄糖氧化酶(glucose oxidase， GOD)裝載于脂質體內，制備超聲響應性納米粒子(nanoparticles， NP)TPZ-GOD NP，以期實現超聲/光聲雙模態成像引導下聲動力聯合饑餓治療小鼠結直腸癌。

1 材料與方法

1.1 主要動物、材料與儀器 37只無特定病原體(specific pathogen free， SPF)級雌性BALB/c小鼠，4～6周齡，體質量18～25 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，飼養于室溫37℃、相對濕度40%～70%環境下，光照明暗周期12 h，自由采食與飲水。

二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dipalmitoyl phosphatidylcholine， DPPC)，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000(distearoyl phosphoethanolamine-methoxy polyethylene glycol 2000， DSPE-mPEG 2000)及膽固醇(西安瑞禧有限生物科技有限公司)，3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine， TMB)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase， HRP)，活性氧熒光探針2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA)，GOD、TPZ及全氟戊烷(perfluoropentane， PFP)(Sigma)，三氯甲烷(重慶川東化工有限公司)，DMEM細胞培養基(Gibico)，胰酶(上海碧云天生物技術有限公司)，細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8， CCK-8)(Dojindo)。

旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器有限公司)，聲振儀(Sonic)，Malvern Zetasizer Nano ZS90粒徑測量儀，Hitachi S-3400N透射電鏡儀，BD流式細胞儀，UV2500-VIS紫外分光光度計，低強度聚集超聲(重慶醫科大學超聲分子影像學研制)，Esaote診斷超聲儀，Visual Sonics Vevo LASER光聲成像儀。

1.2 制備TPZ-GOD NP 采用薄膜水化法制備TPZ-GOD NP。按12∶4∶4∶5比例將DPPC、DSPE-mPEG 2000、膽固醇及TPZ溶解于三氯甲烷溶劑中，50℃下旋轉蒸發2 h，待圓底燒瓶內形成紫色薄膜時加入5 ml磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution， PBS)沖洗底部脂質膜；于冰浴條件下超聲乳化200 μl(5 mg/ml)GOD和200 μl PFP，功率100 W，時間2 min(工作5 s間歇5 s)，之后將其加入上述脂質膜溶液中繼續乳化3 min，功率同前，以低溫離心機離心5 min (5 000 rmp)，收集制備出的TPZ-GOD NP。

1.3 檢測基本性質 以透射電鏡觀察TPZ-GOD NP形態、結構，以馬爾文激光粒度儀檢測其粒徑；利用UV-2 500紫外分光光度計檢測TPZ與GOD的吸收光譜并繪制相關標準曲線，計算TPZ與GOD的包封率與載藥量；檢測TPZ、GOD與TPZ-GOD NP紫外吸收圖譜。采用TMB法驗證TPZ-GOD NP中GOD活性，先配制pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液、1 mg/ml的HRP水溶液、10 mmol/L的葡萄糖溶液以及含10 mg/ml的TMB二甲基亞砜溶液，按緩沖液、TPZ NP/GOD/TPZ-GOD NP、HRP、TMB、葡萄糖的順序混合溶液，待顯色后拍照。吸取上述溶液至96孔板，采用酶標儀測定TMB吸光度值。將制備的TPZ-GOD NP置于EP管內，以超聲輻照(功率2 W/cm2，頻率1 MHz)，200 kDa透析膜過濾溶液，收集液體后采用紫外分光光度計檢測其吸光度值，計算不同時間點下GOD的累計釋放量，繪制GOD藥物釋放曲線。

1.4 細胞吞噬作用 體外培養結直腸癌CT-26細胞，胰酶消化對數生長期細胞，并以1×105個/孔的濃度接種于6孔板內。24 h后棄置孔板內培養基，加入濃度為1 mg/ml DiI修飾的TPZ-GOD NP無血清培養基，繼續培養1、2、3、4、24 h。待胰酶消化收集細胞，以流式細胞儀分析。

1.5 體外活性氧檢測 細胞接種于6孔板24 h后，將其分為對照組、超聲組、TPZ-GOD NP組及TPZ-GOD NP+超聲組。分別向后2組中加入TPZ-GOD NP溶液(1 mg/ml)，孵育3.5 h后加入DCFH-DA溶液繼續孵育0.5 h，以PBS洗去孔板內的TPZ-GOD NP和未進入細胞內的DCFH-DA，再對超聲組及TPZ-GOD NP+超聲組施加超聲輻照30 s，以熒光顯微鏡觀察各組熒光強度。

1.6 體外SDT聯合饑餓治療 取對數生長期細胞以1×104個/孔的濃度接種于96孔板內，將細胞分為對照組、超聲組、SDT組、饑餓治療組及聯合治療組，每組5個復孔。待各孔內細胞密度至80%后，對SDT組加入TPZ NP，饑餓治療組及聯合治療組均加入TPZ-GOD NP溶液(1 mg/ml)，孵育4 h；以PBS洗滌孔板3次后，對超聲組、SDT組及聯合治療組施加超聲輻照30 s；加入CCK-8溶液，檢測各組細胞活性。另將細胞培養于共聚焦培養皿中，待細胞生長至70%～80%、予相同處理后加入鈣黃綠素/碘化吡啶染料染色，于激光共聚焦下觀察細胞顏色。

1.7 體外超聲/光聲成像 將不同濃度TPZ-GOD NP(100、200、300、400、500 μg/ml)轉入凝膠膜型中，超聲輻照30 s，之后采集超聲造影(contrast enhanced ultrasound， CEUS)圖像。將TPZ-GOD NP溶液(2.5 mg/ml)注入凝膠模型中，行光聲激光儀全波長(680～970 nm)掃描，獲取最佳激發波長。體外配置TPZ-GOD NP(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/ml)溶液，以移液器吸取100 μl至凝膠模型中，以最佳激發波長照射，采集相應濃度光聲成像圖，定量分析ROI光聲信號值。

1.8 模型制備及體內超聲/光聲成像 收集對數生長期CT-26細胞，以0.25%胰酶消化后離心重懸。將0.1 ml細胞懸液(約1×106個)于小鼠背部皮下注射，使之形成皮丘；待腫瘤體積約100 mm3時，以Esaote超聲診斷儀，頻率7 MHz線陣探頭采集二維超聲聲像圖。對3只小鼠經尾靜脈注射200 μl TPZ-GOD NP溶液(5 mg/ml)，超聲激發并即刻行腫瘤CEUS。另取3只小鼠行體內光聲成像，分別于經尾靜脈注射NP前后采集腫瘤光聲成像圖。

1.9 體內SDT聯合饑餓治療 對6只小鼠尾靜脈注射DIR熒光染料標記TPZ-GOD NP溶液(5 mg/ml)，于注射后0.5、1、2、4、6、8、24 h經眼球內眥靜脈取血，測量DIR熒光強度，繪制體內血液代謝曲線，計算TPZ-GOD NP半衰期。 8 h后處死小鼠，剖取腫瘤、心、肝、脾、肺、腎組織，測量其內熒光強度。

將其余25只移植瘤小鼠隨機分為5組(n=5)，同1.6。經尾靜脈注射TPZ-GOD NP(5 mg/ml)8 h后，對超聲組、SDT組及聯合治療組以超聲輻照小鼠腫瘤區域10 min，間隔5天重復，期間監測小鼠重量與腫瘤體積。15天后處死小鼠并剝離腫瘤，稱重、切片后行HE染色。

1.10 統計學分析 采用SPSS 22.0統計分析軟件。以±s表示計量資料，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TPZ-GOD NP基本性狀 透射電鏡下TPZ-GOD NP呈球形，大小均一(圖1A)，平均粒徑(262.10±62.92)nm；其中TPZ包封率(76.83±6.07)%、載藥量(14.78±1.16)%，GOD包封率(14.67±3.01)%、載藥量(0.56±0.12)%。TPZ-GOD NP紫外吸收光譜可見2個峰值(257 nm與425 nm處)，即TPZ-GOD NP成功包裹TPZ和GOD(圖1B)。酶活性檢測見GOD和TPZ-GOD NP溶液呈現明顯藍色，而TPZ NP溶液顏色未發生改變(圖1C)；GOD和TPZ-GOD NP的TMB OD值升高(圖1D)。超聲輻照后TPZ-GOD NP釋放 GOD量逐漸增加，隨時間延長，藥物濃度增加，于240 s達到峰值[(78.60±4.62)%]，300 s后逐漸平穩[(77.52±2.89)%](圖1E)。

圖1 TPZ-GOD NP基本性狀 A.透射電鏡圖； B.紫外吸收峰圖； C.GOD酶活性反應； D.GOD酶活性反應后吸光度值； E.超聲激發后TPZ-GOD NP中GOD藥物釋放曲線

2.2 細胞吞噬作用 DiI修飾的TPZ-GOD NP與CT-26細胞共同孵育后細胞內熒光信號逐漸增強，4 h后熒光強度值達到峰值(58.95±6.44)%，24 h后呈下降趨勢。

2.3 體外活性氧檢測 熒光顯微鏡下見超聲激發后TPZ-GOD NP產生大量細胞毒性活性氧，呈明顯綠色熒光；TPZ-GOD NP組可見微弱熒光，其余2組幾無熒光(圖2)。

圖2 熒光顯微鏡下觀察各組活性氧 A.對照組； B.超聲組； C.TPZ-GOD NP組； D.TPZ-GOD NP+超聲組

2.4 體外SDT聯合腫瘤饑餓治療 CCK-8結果顯示，超聲輻照后，聯合治療組細胞存活率明顯低于其余各組(P均<0.05)，見圖3。激光共聚焦顯微鏡下見聯合治療組細胞呈紅色熒光，即明顯凋亡/壞死；SDT組與饑餓治療組見較多綠色熒光；對照組及超聲組細胞呈綠色熒光(圖4)。

圖3 各組細胞存活率比較

圖4 體外鈣黃綠素/碘化吡啶雙染色CT-26細胞圖 A.對照組； B.超聲組； C.SDT組； D.饑餓治療組； E.聯合治療組 (紅色為死亡細胞，綠色為存活細胞)

2.5 雙模態成像 體外CEUS顯示，隨著TPZ-GOD NP濃度增加，超聲顯影效果越強(圖5)，超聲信號逐漸增強。680～970 nm波段激發下，TPZ-GOD NP產生光聲信號，強度值在790 nm處最大。體外光聲成像顯示，隨納米酶濃度增加，光聲信號值逐漸增加，呈明顯線性增強(圖6)。經尾靜脈注射TPZ-GOD NP后，二維超聲及CEUS均可見腫瘤區域超聲信號值顯著增高(P均<0.05)，見圖7。體內光聲成像中，注射TPZ-GOD NP后，腫瘤內光聲信號較注射前明顯增加(P<0.05)，見圖8。

圖5 體外CEUS圖

圖6 體外不同濃度TPZ-GOD NP光聲信號

圖7 小鼠體內超聲圖像

圖8 小鼠體內光聲成像圖

2.6 體內SDT聯合腫瘤饑餓治療 小鼠體內TPZ-GOD NP半衰期為17.32 h。注射后TPZ-GOD主要分布于肝臟、脾臟，富集于腫瘤內。聯合治療組腫瘤生長緩慢，平均(0.19±0.04)g，明顯小于其他各組(P均<0.05)，抑瘤率高達(73.13±5.14)%。各組小鼠體質量均無明顯變化(P均>0.05)。病理結果顯示，聯合治療組腫瘤細胞損傷嚴重，見大量核固縮、核溶解與核壞死；其余各組內仍存在較多腫瘤細胞(圖9)。

圖9 小鼠移植瘤病理圖(HE，×400) A.對照組； B.超聲組； C.SDT組； D.饑餓治療組； E.聯合治療組

3 討論

SDT是在光動力治療(photodynamic therapy， PDT)基礎上發展而來的新型無創治療腫瘤技術[6]，利用聲敏劑與氧在超聲作用下產生具有生物毒性的活性氧而殺傷腫瘤細胞[7]，但殺傷效率有限。近年針對腫瘤微環境進行治療逐漸受到重視。腫瘤較正常組織細胞需要更多葡萄糖以供生長[8]；GOD對β-D-葡萄糖具有高效催化性能及良好的生物安全性[9]。聯合應用聲動力治療與GOD消耗葡萄糖產生的饑餓效應，可實現聲動力/饑餓聯合治療。

卟啉類化合物可增強多種影像學成像[10]。TPZ結構明確、性質穩定、活性氧產量高，可較強吸收超聲聲能，且鋅金屬有利于產生單線態氧[11]，但為脂溶性有機物，不溶于水，生物利用度較低。本研究將聲敏劑TPZ裝載于脂質體殼層，以改善其溶解性能；超聲輻照下可釋放大量活性氧而產生SDT效應，同時可發生“聲致相變”，即液態PFP在超聲作用下氣化，使探針由納米級顆粒變成微氣泡，以增強超聲顯像；此后探針發生爆炸，釋放GOD，與葡萄糖發生反應，產生饑餓效應而殺傷腫瘤細胞。

本研究制備的裝載磷脂的TPZ/GOD納米顆粒形態均一，在水中的分散性好，可憑借腫瘤血管的高通透性和滯留效應透過腫瘤血管內皮間隙，經超聲輻照實現SDT；“聲致相變”產生微氣泡增強超聲信號，局部定點可控釋放GOD而實現SDT。除本身可作為治療劑外，本研究制備的聲敏納米酶顆粒還可作為光聲/超聲分子造影劑，超聲輻照下殼層內PFP發生液氣相變，增強CEUS效果。體外實驗顯示，激光照射后，光聲信號值在690 nm處出現峰值；體內動物實驗進一步證實TPZ成功包裹于NP內，并可用作光聲成像造影劑。雙模態成像支持對比分析2種不同的成像方式，可取長補短，綜合得出更豐富的影像學信息[12]。

本研究制備的相變型聲敏納米酶顆粒在體外成功被CT-26細胞吞噬。TPZ-GOD NP+超聲組細胞內熒光強度明顯高于其余各組，提示活性氧產量較大，為SDT提供了理論基礎；體外聯合治療組細胞存活率最低，而其余各組細胞仍有大量存活，初步證實了聯合治療的作用；體內實驗中，聯合治療組可顯著抑制小鼠腫瘤生長，且生長期間小鼠體質量未發生明顯改變。

總之，本研究成功制備的超聲響應性TPZ-GOD NP可用于超聲/光聲雙模態成像引導下聲動力聯合饑餓治療小鼠結直腸癌，為治療腫瘤提供了新的思路和方法。