基于RNA-seq的谷子萌芽期抗旱相關基因挖掘與分析

代小冬 朱燦燦 宋迎輝 王春義 代書桃 秦 娜 李君霞

(河南省農業科學院糧食作物研究所，河南鄭州 450002)

干旱是限制作物生長發育的主要非生物逆境災害[1]。隨著氣候變化和世界人口的不斷增長，水資源短缺的問題更加突顯，干旱發生的頻率和嚴重程度將會進一步加劇[2]。因此，解析作物抗旱機制、培育抗旱作物品種對減輕干旱災害及其造成的損失具有重要的意義。

谷子[Setaria italica(L.) Beauv]起源于中國，迄今已有8 700 多年的栽培歷史[3]。谷子是二倍體自花授粉植物，且擁有較小的基因組(約430 Mb)。谷子具有生育期短、單株籽粒多、適應性廣、抗旱、耐瘠薄等特點，使其漸漸成為抗旱研究的模式作物。在抗旱性鑒定方法方面，前人相繼確立了谷子萌芽期[4－5]、孕穗期[6]和全生育期[7]的抗旱性鑒定指標，并進行了抗旱性鑒定。在抗旱相關QTL 定位方面，Qie 等[8]利用豫谷1 號與青狗尾草構建的重組自交系(recombinant inbred lines，RIL)群體定位到18 個與谷子抗旱相關的QTL。在參與谷子抗旱的功能基因與蛋白挖掘方面，Tang 等[9]對抗旱品種豫谷1 號和干旱敏感品種安04 在干旱條件下的轉錄組進行分析，并結合抗旱相關QTL 定位結果，確定了20 個抗旱候選基因。趙晉鋒等[10]研究認為SiCIPK19 基因參與了谷子拔節期、抽穗期和灌漿期對干旱脅迫的響應，推測該基因參與谷子對非生物逆境的應答，尤其在抽穗期和灌漿期干旱脅迫應答中發揮重要作用。Wang 等[11]通過對谷子中149 個bHLH 轉錄因子的研究，發現其可能通過調控下游抗旱基因的表達參與谷子的抗旱反應。Feng 等[12]通過分析谷子中39 個核轉錄因子的功能，發現SiNF-YA1 和SiNF-YB8 可以激活相關抗旱基因，提升谷子生理狀態，提高谷子抗旱能力。Pan 等[13]利用定量蛋白質組學分析的方法發現了321個與谷子抗旱性相關的蛋白。

目前雖然在谷子抗旱性研究方面取得了一定的進展，但是由于谷子抗旱機制復雜和研究起步較晚，對谷子抗旱分子調節機制的認識還比較有限，因此在谷子抗旱關鍵基因發掘和干旱分子響應機制方面的研究有待進一步加強。本研究以谷子抗旱品種山西2010 和干旱敏感品種K359*M4－1 為材料，應用轉錄組測序RNA-seq 技術對兩個品種干旱脅迫前后萌發期種子進行轉錄組測定，獲得抗旱相關差異表達基因(differentially expressed genes，DEG)，并通過GO(gene ontology)富集和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析對DEG 進行功能分類，以期挖掘谷子抗旱相關基因，為解析谷子抗旱遺傳機制和指導谷子抗旱育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料K359*M4－1 和山西2010 分別來源于河北省農林科學院谷子研究所和山西省農業科學院經濟作物研究所。

1.2 谷子萌芽期干旱脅迫處理

選用0、10%、15%、20%、25%、30% 6 個聚乙二醇6000(polyethylene glycol 6000，PEG－6000)濃度進行預試驗，篩選出谷子萌芽期抗旱鑒定的PEG 6000 適宜濃度為20%。利用濃度為20%的PEG 6000 對山西2010 和K359*M4－1 進行萌芽期抗旱性鑒定。每份材料選擇飽滿的種子，首先用5%次氯酸鈉消毒15 min，然后用ddH2O 沖洗干凈。選擇50 粒滅過菌的種子放入直徑為9 cm 的培養皿中，再將培養皿放入培養箱，28℃暗培養。干旱脅迫組培養皿中加入5 mL 20%PEG 6000，對照組培養皿中加入5 mL ddH2O。每個試驗設3 次重復。

分別調查第2、第4、第6、第8 天種子的發芽數，并將第2、第4、第6、第8 天種子的萌發率記為nd2、nd4、nd6、nd8。參考Bouslama 等[14]的方法計算萌發指數(promptness index，PI)和萌發抗旱指數(sprout index of drought resisting，SIDR)，PI ＝1.00nd2 ＋0.75nd4 ＋0.50nd6 ＋0.25nd8，SIDR＝處理萌發指數/對照萌發指數。

1.3 RNA 文庫構建和測序

文庫構建和轉錄組測序由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.4 數據的處理與篩選

序列數據由Illumina HiSeq 2500 測序得到的原始圖像數據經base calling 轉化后形成FASTQ 格式的文件，該序列數據包含reads 的序列及堿基的測序質量，在經過去除和過濾含adapter、N 過多或低質量堿基的dirty raw reads 后獲得高質量的clean reads，用于后續的信息分析。

利用轉錄組數據比對軟件TopHat2 將所有的clean reads 與谷子(豫谷1 號)參考基因組序列進行比對。利用比對的reads 計算基因的表達量以確保結果的高準確性。用FPKM (fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)值衡量計算表達量。分別利用GOseq R 和KOBAS 軟件包進行差異表達基因的GO 和KEGG 富集分析(偽發現率false discovery rate，FDR<0.05)。

本研究報道的原始數據已存入中國科學院北京基因組研究所大數據中心基因組序列檔案庫，accession ID:CRA002537。公眾可訪問網址:https:/ /bigd.big.ac.cn/gsa 獲取數據。

1.5 實時熒光定量PCR 分析

為了驗證谷子萌芽期干旱脅迫轉錄組結果的準確性，從DEG 數據庫中隨機挑選28 個基因，利用Primer 6.0 設計引物(表1)，分析實時熒光定量PCR(realtime quantitative PCR，RT-qPCR)結果是否與轉錄組測序結果一致。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequence

2 結果與分析

2.1 干旱處理對谷子發芽的影響

以濃度為20%的PEG 6000 對91 份谷子材料的萌芽期抗旱性進行評價。由圖1可知，山西2010 的萌發抗旱指數(sprout index of drought resisting，SIDR)達到92%，抗旱性較強，而K359*M4－1 的萌發抗旱指數僅為64%，抗旱性較弱。

根管充填即刻質量評價標準[1]（1）適充：根充材料距解剖根尖≤2mm,根管三維充填封閉嚴密；（2）超充：根管充填材料超出根尖孔；（3）欠充：根充材料距解剖根尖＞2mm或者根管三維充填不嚴密，X線顯示根充物不致密。

圖1 干旱脅迫對山西2010 和K359*M4－1 發芽的影響Fig.1 Effects of drought stress on germination of Shanxi 2010 and K359*M4－1

2.2 干旱處理萌芽期谷子種子的轉錄組分析

利用RNA-seq 技術對山西2010 和K359*M4－1萌芽期種子進行轉錄組測序。將干旱處理前后山西2010 樣品分別命名為SC 和ST，將干旱處理前后K359*M4－1 樣品分別命名為KC 和KT。將校正后P<0.05 作為標準篩選每個比較組的DEG。結果顯示，山西2010 干旱處理前后(SC vs ST)共鑒定到2 300 個DEG，其中上調基因有1 002 個，下調基因有1 298 個。K359*M4－1 干旱處理前后(KC vs KT)共鑒定到3 652個DEG，其中上調基因1 861 個，下調基因1 791個。綜上可知，在干旱脅迫下，與抗旱品種山西2010相比，干旱敏感品種K359*M4－1 的代謝發生了更大的變化。

韋恩圖分析顯示，干旱脅迫處理前后山西2010 和K359*M4－1 之間存在1 268 個共有DEG，在山西2010 和K359*M4－1 2 個品種中分別存在1 032 個和2 384 個特有的DEG(圖2)。這些基因參與了谷子對干旱脅迫的響應，并可以用來解釋2 個谷子品種的抗旱性差異。

圖2 DEG 表達韋恩圖Fig.2 Venn diagrams of DEGs among different comparisons

2.3 DEG 功能分析

為了進一步探索谷子對干旱脅迫的響應機制，將矯正后P<0.05、閾值(｜Log 2 fold change ｜≥2)作為標準篩選每個比較組的DEG。分別在山西2010 和K359*M4－1 中鑒定到82 個(40 個上調基因，42 個下基因調)和112 個(51 個上調基因，61 個下調基因)DEG(表2)。DEG 主要為編碼類鋅誘導的促進因子蛋白、類萌發素蛋白、蛋白質磷酸酶、轉運蛋白、胚胎發育晚期豐富蛋白、轉錄因子、過氧化物酶等的基因。

表2 部分谷子萌芽期響應干旱脅迫DEGTable 2 Part of DEGs response to drought stress at germination stage of foxtail millet under drought stress

2.4 DEG 功能富集分析

通過對不同比較組鑒定到的DEG 進行GO 和KEGG 代謝途徑富集分析。根據GO 功能注釋，SC vs ST 和KC vs KT 中的DEG 分別富集在52 個和21 個生物學過程。主要集中在催化活性(GO:0003824)、單個有機體代謝過程(GO:0044710)、氧化還原過程(GO:0055114)、血紅素結合(GO:0020037)、四吡咯結合(GO:0046906)等生物學過程(表3)。

表3 干旱脅迫下谷子DEG 的GO 富集分析Table 3 GO enrichment analysis of s DEGs in foxtail millet under drought stress

KEGG 富集分析表明，不同比較組鑒定到的DEG主要富集在淀粉和蔗糖代謝，植物激素信號轉導，光合作用－天線蛋白，苯丙素生物合成，角質、亞氨酸和蠟生物合成，次生代謝物的生物合成等途徑(圖3)。

圖3 干旱脅迫下山西2010(A)和K359*M4－1(B)中DEG 的KEGG 富集圖Fig.3 KEGG enrichments map of the DEGs in Shanxi 2010(A) and K359*M4－1 (B) under drought stress

2.5 實時熒光定量PCR 驗證

圖4 實時熒光定量PCR 結果Fig.4 Confirmation of the transcriptomic profiles of selected genes by RT-qPCR

3 討論

RNA-seq 可以全面地獲得某一物種特定細胞或組織在某一狀態下的幾乎所有的轉錄本及基因序列，是一種快速、有效鑒定差異表達基因的方法，是揭示植物抗逆機理以及篩選抗逆基因的主要研究技術[15－20]。本研究利用RNA-seq 在全基因組表達水平上鑒定了谷子萌芽期的抗旱基因。通過對干旱處理前后抗旱品種和干旱敏感品種的轉錄組比較，在山西2010 和K359*M4－1 中分別發現了2 300 個和3 652 個可能參與干旱脅迫響應的DEG。這些基因的表達和調控能使谷子抵御干旱脅迫的危害。進一步比較發現，K359*M4－1 中的DEG 明顯多于山西2010 中的DEG，表明在干旱脅迫下，與抗旱品種相比，干旱敏感品種的代謝發生了更大的變化。上述結果與前人研究結果一致[21－22]。

本研究中，DEG 功能富集分析結果表明，DEG 顯著富集于氧化還原相關的生物學過程，表明植物可以通過調控活性氧代謝來保護細胞膜的穩定性，從而提高植物的抗旱性[23－24]。苯丙素生物合成、次生代謝物生物合成、淀粉和蔗糖代謝、苯丙氨酸代謝等途徑顯著富集在兩個比較組中。植物次生代謝產物是在長期進化過程中植物與生物和非生物因素相互作用的結果，在植物對環境脅迫的適應過程中發揮重要作用[25]。當植物處于干旱環境時，植物次生代謝產物會通過減緩淀粉代謝來保存能量以延長細胞的存活時間[15]。說明富集在這些途徑上的基因在谷子響應干旱脅迫方面發揮了重要作用。

本研究獲得了很多與干旱脅迫相關的DEG，如編碼類鋅誘導促進因子蛋白的基因Seita.3G089200 在兩個比較組中的表達都表現明顯上調。前人研究表明，類鋅誘導促進因子可以通過調節氣孔的關閉提高植物的抗旱性[26]，因此，推測Seita.3G089200 參與了谷子對干旱的響應。

在植物中，鉀不僅是生長發育所必需的宏量營養素，而且是介導植物響應脅迫的主要信號[27]。鉀吸收透性酶/高親和力鉀轉運體/鉀轉運體(K＋uptake permease/high-affinity K＋transporter/K＋transporter，KUP/HAK/KT)轉運蛋白在調控甘蔗響應低鉀、干旱和鹽脅迫方面發揮了重要作用[28]。本研究發現2 個編碼KUP/HAK/KT 轉運蛋白的基因(Seita.9G182400和Seita.9G182500)在干旱脅迫下上調表達。表明這些基因可能是參與谷子抗旱的關鍵基因。ABC 轉運蛋白參與跨膜運輸、信號傳導和細胞解毒等多種重要的生理過程，使植物能夠適應環境的變化，并調節植物對生物和非生物脅迫的反應[29]。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中超表達AtABCG36 可以顯著增強相株的抗旱性[30]。

本研究發現4 個編碼ABC 轉運蛋白的基因(Seita.9G001100、Seita.9G447200、Seita.3G042600 和Seita.2G290000)參與了谷子對干旱脅迫的響應。類萌發素蛋白基因受多種環境信號誘導，在植物生長發育及對非生物脅迫、生物脅迫的響應中起著重要的作用[31－34]。超表達大豆(Glycine max)的GmGLP7 可以提高擬南芥的抗旱性和抗氧化能力[35]。本研究有10個編碼類萌發素蛋白的基因在干旱脅迫下差異表達，推測這些基因與谷子抗旱性相關。蛋白質磷酸酶是許多信號轉導途徑的調控因子，在植物抗氧化、耐冷、抗旱等過程中起關鍵作用[36]。如煙草(Nicotiana tabacum)中的NtPP2C1 的表達受干旱誘導，在干旱脅迫條件下的表達顯著提高[37]。本研究中，在干旱條件下，谷子中3 個編碼蛋白質磷酸酶的基因(Seita.7G021400、Seita.6G005300 和Seita.3G218800)表達上調，可能參與了谷子對干旱脅迫的應答。轉錄因子可通過調控多個下游靶基因的表達，誘導多種非生物脅迫的保護機制[38－40]。如NAC、MYB、bHLH、AP2/ERF 等轉錄因子直接或間接參與抗旱響應[41－43]。本研究發現編碼NAC 轉錄因子基因Seita.2G028200、編碼MYB 相關蛋白基因Seita.1G374700、bH035 的同源基因Seita.7G045200 的表達在干旱脅迫前后差異顯著，推測這些基因可能通過調節相關基因表達參與谷子對干旱的響應。LEA 蛋白參與植物對各種非生物和生物脅迫響應，包括鹽害[44]、干旱[45]、熱害[46]、冷害[47]等。提高LEA 蛋白基因的表達可以提高植物的耐旱性[48－50]。本研究中，編碼LEA 蛋白的Seita.2G437900、Seita.9G420500、Seita.5G287800 和Seita.3G162400 在干旱脅迫下表達顯著上調，表明這些基因可能與谷子抗旱相關。當植物遭受干旱脅迫時，其通過抗氧化酶系統保護組織免受由于活性氧積累導致的氧化損傷[51]。過氧化物酶是一種抗氧化酶，在植物抗旱脅迫過程中發揮重要的作用[52]。本研究發現，Seita.7G247400 和Seita.3G052900 在谷子受到干旱脅迫時，表達顯著上升，推測它們可能參與了干旱脅迫下谷子中活性氧的清除過程。

4 結論

本研究通過對干旱脅迫前后2 個谷子品種的萌芽期種子進行轉錄組分析，獲得了一批包括編碼類萌發素蛋白、蛋白磷酸酶、LEA 蛋白、轉錄因子、ABC 轉運蛋白等與干旱脅迫相關的基因。DEG 顯著富集在淀粉和蔗糖代謝，植物激素信號轉導，光合作用－天線蛋白，苯丙素生物合成，角質、亞氨酸和蠟生物合成，次生代謝物生物合成等途徑，表明這些途徑參與了谷子的抗旱反應。本研究結果為解析谷子抗旱機制、篩選谷子抗旱品種奠定了很好的理論基礎。