河南省小麥莖基腐病調查及優勢病原分析

胡海燕 董清峰 李冬梅 周 鋒 劉起麗 劉明久 李成偉

(1河南科技學院生命科技學院，河南新鄉 453003；2河南省糧食作物基因組編輯工程技術研究中心，河南新鄉 453003；3河南科技學院資源與環境學院，河南新鄉 453003)

近年來，我國氣候變化多樣、溫度極其不穩定，加重了小麥病害的發生[1－2]。莖基腐病(crown rot，CR)，是由多種鐮孢菌復合侵染而引起的世界性土傳病害[3]，美國、澳大利亞等10 多個國家已報道其發生及危害[4]。同時，該病在南非、埃及、敘利亞、摩洛哥和阿根廷等國家麥類作物種植區也呈現越來越嚴重的趨勢，受到各國科研工作者的廣泛關注[5－8]。已有研究表明，CR 可導致小麥減產達35%左右，部分地塊損失率甚至高達100%[9－10]。此外，被CR 侵染的植株及籽粒中會因產生毒素而嚴重威脅人畜健康[11]。

2012年小麥CR 在河南省首次被報道[12－13]以來，河南和山東大部分地區、河北中南部、安徽北部、江蘇北部、山西南部、陜西中東部等黃淮麥區主產地均發現小麥CR 的發生[12，14－15]。目前，該病已成為我國小麥生產的主要病害，給我國小麥生產帶來了嚴重的威脅[1，16]，其中河北省小麥CR 普遍發病率高達80.6%～100.0%[15]，河南省的一些地區因CR 造成小麥減產達30%以上[1，17－18]。引起我國小麥CR 的主要病原菌有禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、假禾谷鐮刀菌(Fusarium pseudograminearum)、小麥根腐離蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)、木賊鐮刀菌(Fusarium equiseti)、三線鐮刀菌(Fusarium tricinctum)和層出鐮刀菌(Fusarium proliferatum)[12，19]。目前，對小麥CR 的防控一般采用農業措施和化學防治[13]，且尚未選育出高抗CR 的小麥品種。因此，明確我國小麥主產地河南省小麥生產上CR 發病的最新發展動態，進一步明確當前流行的優勢病原菌類型，有目的地針對優勢病菌引起的小麥CR 開展防控顯得尤為重要。本研究于2019年5月對河南省11 個小麥主要產區的96 個生產點進行了CR 調查，分離鑒定主要病原菌并測定其致病力，以期為小麥CR 的有效防治提供準確的信息，同時為加快小麥CR 致病和抗病機理研究以及抗病育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 調查地點 調查地點為河南省的小麥主要生產區，包括濮陽、安陽、新鄉、鶴壁、焦作、開封、周口、商丘、駐馬店、平頂山、南陽市等11 個地區的36 個鄉96個生產點。

1.1.2 病原菌和小麥品種 供試病原菌從不同調查地點發病田塊的典型發病小麥植株上分離。病原菌致病力鑒定所用小麥品種為百農207(2018年河南省秋播面積較大品種，全國農業技術推廣服務中心統計數據)。

1.2 試驗方法

1.2.1 病情調查方法 根據小麥CR 癥狀[1，13]進行發病情況調查。田間調查方法參照地方標準DB37/T 3404－2018[20]，即每塊地采用5 點取樣法(對角線Z字)，每點取20 個小麥單莖，記錄發病等級，發病等級分為10 級:0 級:整株莖稈無癥狀；1 級:地上部基部第1 葉鞘褐變，但莖節沒有病變；3 級:地上部分第1 莖節褐變；5 級:地上部分至第2 莖節褐變；7 級:褐色病斑超過第2 莖節，但無白穗；9 級:褐色病斑超過第2 莖節，產生白穗或因發病而無穗。發病田塊調查:每個調查點，調查10～20 個小麥田塊，調查每田塊中發病小麥白穗情況。根據5 級分類記錄發病田塊的白穗率:0級:整體無白穗；1 級:白穗率在0～10%之間；2 級:白穗率在10%～20%之間；3 級:白穗率在20%～50%之間；4 級:白穗率大于50%。根據公式計算病情指數、病株率和田塊發病率:

1.2.2 病原菌分離及形態觀察 從不同地區調查點的小麥田塊中采集具有CR 典型癥狀的小麥植株樣本[13]，剪取小麥莖基部病斑部位，剪成長約0.2 cm 的小片段，用75%酒精和2.5%次氯酸鈉進行表面消毒，再用無菌水清洗，無菌紙吸干水分后放置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養基(馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 L)上，于25℃培養室中活化3 d，然后挑取單個菌株接種到新鮮的培養基上進行分離純化培養，待72 h 菌絲長滿后打成菌餅(d ＝5 mm)，放入液體PDA 培養基，25℃條件下180 r·min－1振蕩培養4 d 左右，直至孢子產生，期間持續觀察各菌株的菌落形態、菌落顏色及分生孢子形態，參考Leslie 等[21]的鐮刀菌分類系統對不同形態菌株進行分類鑒定。

1.2.3 病原菌基因組DNA 提取及rDNA-ITS 分子鑒定 將上步分離純化的菌株活化后，接種到新鮮的PDA 培養基平板上，25℃培養箱中培養一周，收集菌絲，用液氮迅速冷凍并研磨成粉末，采用CTAB 法提取菌絲基因組DNA。使用rDNA-ITS 序列特異性引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGCG-3′)，ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[22]，以病原菌基因組DNA 為模板進行PCR 擴增，擴增程序為:94℃預變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸15 s(共循環35 次)，72℃延伸10 min，4℃保存。擴增產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將得到的目的擴增產物送武漢金開瑞生物工程有限公司測序，對測得的序列在美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)上進行核酸序列比對。從GenBank 中下載F.pseudograminearum(假禾谷鐮刀菌)和F.tricinctum(三線鐮刀菌)的rDNA-ITS 特異區域序列，用MEGA7 軟件的鄰接法(neighborjoining，bootstrap method 值設為1 000) 構建進化樹[23]。

1.2.4 病原菌致病力分析 病原菌致病力鑒定采用Demirci 等[24]的方法，測定病原菌對小麥的致病力。將消毒后的小麥百農207 種子與活化7 d 的病原菌菌餅(d＝5 mm)一起播種于8 cm 的盆缽中，營養土與蛭石以2 ∶1比例混合；每缽種5 粒小麥，設3 次重復，同時設置未接種的對照。將接種菌餅的小麥放入25℃、14 h/10 h 光周期的光照培養箱中培養，50 d 后調查小麥幼苗發病情況。調查時將小麥從土中取出，記錄莖基部癥狀，病級評價標準按照Grey 等[25]的方法分為四級:0級:無癥狀；1 級:1%～25%褐變；2 級:25%～50%褐變；3級:>50%褐變。按照公式(1)計算病情指數。

2 結果與分析

2.1 河南省小麥CR 發生情況

2019年5月小麥灌漿期對河南省11 個小麥主要產區的96 個生產點田間CR 病情指數、病株率、白穗率和田塊發病率進行了調查，田間調查的小麥CR 發病癥狀見圖1。結果顯示，CR 的病情指數在0～42.36之間(圖2)，平均為17.78，其中最高的是焦作，其次是濮陽和新鄉，而駐馬店地區的病情指數幾乎為0(0.028)；病株率平均達48.35%(圖3)，其中7 個地區的病株率在50%以上，最高達86.75%；發病致死率即白穗率在0～8.13%之間，平均為3.44%(圖3)；田塊發病率平均為78.85%，除了駐馬店地區幾乎不發病外，其他地區的田塊發病率都超過了50%，最高達100%，最低為56.25%(圖4)。

圖1 田間調查的小麥植株CR 癥狀Fig.1 CR symptoms of wheat plants investigated in field

圖2 不同地區小麥CR 病情指數Fig.2 The disease index of wheat CR in different investigation areas

圖3 不同地區小麥CR 的病株率和白穗率Fig.3 The rate of diseased plant and the white head incidence of CR in different investigation areas

圖4 不同地區小麥CR 田塊發病率分布圖Fig.4 The disease field rate distribution of wheat CR in different investigation areas

被調查到的小麥品種對CR 抗性存在明顯差異，其中發病較輕的品種占30%，發病較重的品種占20%，其他50%屬于中間類型。調查過程中發現，發病程度與品種特性存在一定關系，其中偏春性品種發病輕，強筋優質品種發病相對較重，但差異不顯著(數據未列出)；同一品種在不同地區(地塊)發病程度存在較大差異，大多數品種的發病程度受氣候和土壤條件以及管理措施影響，其中干旱和鹽堿地塊發病較重，土壤肥沃、雨水充足或水澆地發病較輕甚至不發病，管理粗放、缺乏肥水管理的地塊發病較重。如百旱207 在南陽的干旱地塊發病嚴重，病情指數達到了27.67，而在周口雨水充足地塊發病較輕，病情指數僅為0.67，相差41 倍；百農4199 平均病情指數為10.98，在南陽的干旱地塊病情指數為15.44，而在駐馬店雨水充足地塊不發病；豐德存5 號在周口和商丘兩個雨水充足地區未見發病，在新鄉的半干旱和焦作的鹽堿地塊發病較重(病情指數分別為50.67 和23.00)；鄭麥369在南陽地區兩個正常管理地點發病相對較輕(病情指數分別為12.22 和14.56)，而在焦作的鹽堿地塊和新鄉的干旱地塊病情指數分別達到44.67 和31.44。調查中也發現即使進行了常規病蟲害防治的田塊，仍有不同程度的CR 發生。以上結果表明，生態氣候條件和田間管理措施是影響小麥CR 發病程度的重要因素，目前還缺乏對小麥CR 的有效防治藥劑。

2.2 小麥CR 病原菌形態特征分類

從不同地區典型CR 發病小麥植株上共分離得到49 株小麥CR 菌株，根據菌落特征分為7 類，分別標記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ(圖5)，分別分離到18、20、4、2、3、1 和1 株。不同類別之間的菌斑形態和菌斑顏色上存在差異，其中，第Ⅰ類型菌絲為純白色絨狀，在PDA 平板靠近中心位置周邊生長旺盛，其他區域菌絲生長稀疏，背面顏色為鮮紅色；第Ⅱ類和第Ⅳ類與第Ⅰ類之間除顏色稍有不同外，其他特征相似；第Ⅲ類菌絲多數為黃色絨狀，菌絲生長密集，有明顯的聚集，分布不均勻，背面顏色有明顯的層次感，內圈為淺紅色，外圈則為黃色，第Ⅴ類和第Ⅶ類與第Ⅲ類之間除顏色不同外基本相似；而第Ⅵ類菌絲生長不旺盛，菌絲純白間紫紅色，當生長到一定直徑時不再橫向生長，背面只有中心呈環形深紅色且分布不均勻，與其他類型菌株有明顯不同。7 種類型病原菌的分生孢子均為鐮刀狀(圖6)，但孢子橫隔數目不同，其中第Ⅰ類和第Ⅶ類有5 個橫隔，第Ⅳ類和第Ⅴ類有3 個橫隔，第Ⅱ類和第Ⅲ類無橫隔。

圖5 不同類型CR 病原菌的菌落形態Fig.5 Morphological characteristics of different types CR pathogens

圖6 不同類型CR 病原菌的孢子形態Fig.6 Conidia morphology of different types of CR pathogens

2.3 小麥CR 病原菌的分子鑒定

對上述7 種類型病原菌分別進行rDNA-ITS 特異序列擴增，擴增產物(圖7) 經測序，序列提交至GenBank(序列號:MW341493-MW341499)，并上傳NCBI 數據庫中進行序列比對，核酸序列比對結果顯示，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅶ6 種類型病原菌序列與假禾谷鐮刀菌(F.pseudograminearum)的序列有較高的同源性，相似度為99.45%～99.63%；而第Ⅵ類型病原菌序列與三線鐮刀菌(F.tricinct)序列有較高的同源性，相似度達99.82%。對7 種類型病原菌的rDNA-ITS 特異序列進行進化樹分析，結果如圖8所示，其中第Ⅱ、第Ⅰ和第Ⅶ類與假禾谷鐮刀菌的進化關系最近，之后依次是第Ⅳ、第Ⅴ、第Ⅲ類，第Ⅵ類與三線鐮刀菌關系最近。7 種不同病原菌在河南省內的分布存在差異，其中，第Ⅰ類在濮陽、平頂山、周口、焦作、安陽、鶴壁、新鄉和商丘8 個地區均有分布，第Ⅱ類在安陽、駐馬店、新鄉、周口、商丘和南陽等6 個地區有分布，第Ⅲ、第Ⅳ和第Ⅴ類只分布到2 或3 個地區，而第Ⅵ和Ⅶ類均只在1 個地區出現。因此認為，河南省小麥莖基腐病的優勢病原菌為假禾谷鐮刀菌，目前的流行病原菌為第Ⅰ類和第Ⅱ類。

圖7 不同類型CR 病原菌rDNA-IST 特異區域PCR擴增片段電泳圖Fig.7 Electrophoregrams of PCR amplified rDNA-IST specific fragments from different types of CR pathogens

圖8 不同類別CR 病原菌的rDNA-ITS 區域特異序列系統進化樹Fig.8 Phylogenetic tree based on the combined rDNA-ITS region sequences of 7 Fusarium species associated with CR

2.4 不同類型小麥CR 病原菌的致病力

利用苗期室內接種鑒定方法對7 種不同類型病原菌的致病性進行了分析。從接種病原菌7 d 后的小麥幼苗發病癥狀上看，小麥莖基部已出現大量的白色菌絲，大部分類型菌絲已經分泌紅色的次生代謝產物，小麥胚芽鞘出現明顯的褐化，且小麥幼苗的生長受到明顯的抑制，感病嚴重的小麥在出土2 cm 就表現出明顯的衰亡跡象；第Ⅵ類三線鐮刀菌在接種后菌絲正常生長，只侵染小麥的葉鞘組織，對小麥植株的生長影響較小。接種50 d 后的小麥植株發病結果顯示，不同類型病原菌對小麥幼苗的致病力存在顯著差異(圖9)，7種類型病原菌的致病力平均病情指數為70.63，其中第Ⅲ類的病情指數最高達到92.22，第Ⅵ類三線鐮刀菌的病情指數最小為33.33。而且同為假禾谷鐮刀菌的不同類型病原菌(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅶ)之間的致病力存在明顯差異，致病力強弱依次為Ⅲ>Ⅴ>Ⅶ>Ⅳ>Ⅱ>Ⅰ。從病原菌來源地看，分布最廣的病原菌即第Ⅰ和第Ⅱ類的病情指數分別為42.22 和77.78，表明河南省大部分地區的CR 病原菌傳播能力較強，致使河南省小麥主產區大面積均有CR 發生。

圖9 不同類型CR 病原菌致病力Fig.9 The virulence of different CR pathogens

3 討論

近年來，CR 在我國小麥生產中頻繁發生，徐飛等[13]對2013—2016年的小麥CR 發病情況進行了調查，發現病田率從2013年的45.8%增至2016年的65.1%，且干旱的地塊發病嚴重。本研究對河南省的11 個小麥主要產區CR 發病情況及優勢病原進行了調查和分析。結果顯示，除了駐馬店地區幾乎不發病外，其余地區都存在不同程度的發病情況，占調查總數的90.91%，平均病情指數達17.78，嚴重地塊白穗率達8.13%，且田塊發病率平均高達78.85%，表明CR 在河南省小麥生產中已普遍發生，且傳播呈現加重趨勢，嚴重影響小麥高產穩產。

目前，我國生產上還沒有對CR 具有免疫和高抗的小麥品種，因此，造成我國小麥CR 普遍發生[26－28]。本研究結果也顯示，河南省小麥生產上缺乏對CR 免疫或高抗的品種，因此急需加快抗性品種的篩選和種質創制。本調查初步發現，不同的小麥品種特性(冬春性和品質特性)之間發病程度存在差異，但由于田間調查范圍廣、氣候和土壤條件不一致等原因，小麥品種特性與抗病之間的關系有待進一步研究；同時也發現同一品種在不同地區的發病程度也存在較大差異，即干旱、鹽堿地和缺少肥水管理等造成CR 嚴重發生，而水澆地、雨水充足和水肥管理好的地塊發病較輕或不發病，與前人研究結果一致[1]。因此，通過栽培措施和管理方式可以有效控制小麥CR 的發生程度。

造成黃淮麥區小麥CR 的病原菌為多種鐮刀菌，但不同地區的病原菌種類存在差異，其中禾谷鐮刀菌和假禾谷鐮刀菌為主要優勢病原菌[12，19]。本研究根據收集到的病原菌形態和分子鑒定結果顯示，2019年河南省大部分小麥生產區的CR 優勢病原菌以假禾谷鐮刀菌為主，存在6 種不同類型，它們的分離頻率以及在河南省的分布存在差異，其中，第Ⅰ和Ⅱ類病原菌分離頻率高且地區分布廣。因此推測，造成河南省當前小麥CR 普遍發生的優勢病原菌為假禾谷鐮刀菌，流行病原為第Ⅰ和Ⅱ類病原菌。2016年之前河南南部地區的菌株致病力相對較弱，病情指數為6.67[12，29]，本研究分離到的不同類型優勢病原菌均具有很強的致病力，病情指數最低為42.22，比2016年賀小倫[29]鑒定的病情指數高出6 倍，表明CR 病原菌的致病力越來越強，造成的危害將會越來越嚴重。田間調查還發現，雖然生產中通過藥劑拌種和大田防治，但CR 仍然普遍發生，表明目前生產上還沒有針對CR 的特效化學和生防藥劑，因此，需要加快針對優勢流行病原菌致病機理開展研究、篩選高效的防治藥劑及探討有效的防治途徑。

4 結論

河南省11 個小麥主產區均有不同程度CR 發生，調查到的小麥品種也均不同程度感病，不同氣候和土壤條件地塊間發病程度差異較大；河南省小麥CR 主要病原菌為假禾谷鐮刀菌，根據菌落形態特征分為6種類型，其中第Ⅰ和Ⅱ類為優勢病原菌株。該結果為開展小麥CR 的防控、致病機理、抗病機理的深入研究提供了依據，對提高小麥抗病育種效率、確保糧食生產安全具有重要意義。