不同顏色蠶豆種皮酚類物質組成及抑菌活性研究

張 杰 楊希娟 黨 斌 張文剛 蘭佳佳

(1青海大學農林科學院，青海西寧 810016；2青海省農林科學院，青海省青藏高原農產品加工重點實驗室，青海西寧 810016； 3中國農業大學曲周實驗站，河北曲周 057250)

蠶豆(Vicia fabaL.)俗稱胡豆、佛豆、南豆、羅漢豆、寒豆、川豆和利馬豆等，是一種高蛋白、低脂肪、富淀粉的作物[1－2]，為糧食、蔬菜、飼料和綠肥兼用作物。蠶豆富含有益健康的酚類物質[3]，研究表明這些酚類物質具有多種生物活性，如抗氧化性[4－5]、降血糖[6－7]和降血脂[8－9]作用。Belhaoues 等[10]、Sahayarayan等[11]和Lu 等[12]研究發現酚類物質還具有抑菌活性，且不同酚類物質組成與抑菌活性存在一定相關性。但目前關于蠶豆的研究大多集中在蠶豆籽粒方面，而蠶豆種皮較厚、易剝離，通常被當作廢料處理，造成極大的浪費，不利于蠶豆的綜合利用。針對種皮的利用研究，當前僅有部分學者進行了探討。蘇適等[13]研究證明黑豆皮中的花青素具有顯著抑菌作用，為黑豆的進一步開發提供了理論依據。褚盼盼等[14]也報道證明了黑豆皮中花青素對枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大腸桿菌(Escherichia coli)抑菌活性較高，說明豆類種皮中的酚類物質能夠抑制某些病原菌及腐敗菌的活性，一定程度上加強了原料的綜合利用。

目前關于蠶豆酚類物質的研究中，大多以蠶豆籽粒為研究對象，且研究內容大多集中在酚類化合物的提取工藝優化[15]、總酚、總黃酮、總花青素的含量測定、酚類化合物組成分析及抗氧化活性[16]等方面，而針對蠶豆種皮酚類物質的報道較少。蘭佳佳等[17]僅針對蠶豆皮中的原花青素進行了提取工藝優化及抗氧化活性分析。但針對蠶豆種皮抑菌活性的研究報道甚少，同時針對不同顏色蠶豆種皮提取液抑菌活性及不同酚類物質組成與抑菌活性相關性的研究更鮮見報道。因此，本研究以5 種不同顏色蠶豆種皮為原料，探討不同顏色蠶豆種皮的酚類化合物組成、抑菌活性及其相關性，以期為蠶豆種皮綜合加工利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陵西1 寸、黑蠶豆、紫紅蠶豆、青蠶18 號、2005－00，其種皮顏色分別為綠色、黑色、紫紅色、純白色、灰色，詳見圖1。2016年6月采集于青海西寧青海省農林科學院的試驗地內，由青海省農林科學院豆類研究室提供。5 種不同顏色蠶豆種皮經人工去皮收集后干燥并粉碎，冷藏備用。

圖1 不同顏色的蠶豆Fig.1 The different colors of faba beans

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌(Salmonella)由西北農林科技大學食品學院微生物實驗室提供；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂購自北京奧博星生物技術有限責任公司，1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(1，1－diphenyl－2－picryhydrazyl，DPPH)、2，4，6－三吡啶基三嗪[2，4，6－Tris(2－pyridyl)－s－triazine，TPTZ]、Trolox(水溶性維生素E)、2，2－聯氮－二(3－乙基－苯并噻唑－ 6 － 磺酸) 二銨鹽[2，2′ － azino － bis ( 3 －ethylbenzothiazoline－6－sulfonic acid)，ABTS]，美國Sigma 公司；沒食子酸、根皮酚、原兒茶酸、綠原酸、兒茶酸、2，4－二羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4－香豆酸、蘆丁、阿魏酸、水楊酸、咖啡酸、鞣花酸、原花青素A2、原花青素B2、柚皮苷、橙皮苷、苯甲酸、鄰香豆酸、楊梅素、槲皮素、藜蘆酸、柚皮素、山柰酚標準品(純度≥98.0%)，上海源葉生物科技有限公司；福林酚(優級純)，北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為分析純，購自天津市富宇精細化工有限公司。

1.2 儀器與設備

FW200 高速中藥粉碎機，天津華鑫儀器廠；AL204萬分之一分析天平，梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司；KQ－500DE 型數控超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司；LRH－150 生化培養箱，上海齊欣科學儀器有限公司；N4S 紫外線可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；DL－5M 低速冷凍離心機，湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司；LDZX－75KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；SW－CJ－2D 雙人凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司，Q-Exactive 高效液相質譜聯用儀，美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蠶豆種皮提取液的制備 在前期研究基礎上[14]選擇70%丙酮和0.5%鹽酸為提取溶劑，料液比1 ∶10(m∶v)，于450 W、45℃超聲提取25 min，得到蠶豆種皮提取液。

1.3.2 總酚、總黃酮、花色苷含量的測定 總酚含量采用Folin-Ciocalteu 法[18]測定。以沒食子酸為標準品，得到回歸方程為Y＝0.004 2X＋0.012 4(R2＝0.999 0)，根據回歸方程計算蠶豆種皮的總酚含量。總黃酮含量采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法[19]測定。以蘆丁為標準品繪制標準曲線，得到回歸方程為Y＝0.005 5X－0.004 7(R2＝0.994 7)，根據回歸方程計算總黃酮含量。花色苷含量采用pH 示差法[20]測定。

1.3.3 蠶豆酚類物質組成及含量分析 采用高效液相色譜質譜聯用法( high performance liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS/MS)分析蠶豆提取液中抗氧化活性成分的組成及含量，參照陳青青等[21]的方法。蠶豆中酚酸、黃酮類物質組成的測定條件:液相條件:色譜系統:Dionex Ultimate 3000 RSLC； 色譜柱:Hypersil GOLD aQ，100 mm×2.1 mm，1.9 μm；流動相:0.9%乙酸水溶液/甲醇；進樣量:3 μL；梯度洗脫，流速:0.30 μL·min－1。質譜條件:質譜系統:Thermo Q-Exactive；負離子模式掃描；噴霧電壓:2.8 kV；毛細管溫度:300℃；加熱器溫度:300℃；鞘氣體流量:35 arbitrary units；輔助氣體流量:10 arbitrary units；掃描方式:全掃描(分辨率70 000)；掃描范圍:m/z 100～1 500。

蠶豆中花色苷類物質組成的測定條件:色譜系統:Dionex Ultimate 3000 RSLC:色譜柱:Hypersil GOLD aQ，100 mm×2.1 mm，1.9 μm；流動相:0.9%乙酸水溶液/0.9%乙酸乙腈；進樣量:3 μL；梯度洗脫，流速:0.30 μL·min－1。質譜條件:質譜系統:Thermo QExactive；正離子模式掃描；噴霧電壓:3.5 kV；毛細管溫度:300℃；加熱器溫度:300℃；鞘氣體流量:35 arbitrary units；輔助氣體流量:10 arbitrary units；掃描方式:全掃描(分辨率70 000)；掃描范圍:m/z 100～1 500。

1.3.4 菌種的活化 用接種環分別挑取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌菌種，接種于100 mL 的營養肉湯培養基中，于37℃恒溫培養箱中培養12 h，以相同的接種方法進行純化培養2～3 代。

1.3.5 抑菌活性測定 將無菌牛津杯貼于含菌平板上，用移液槍加入滅菌的蠶豆提取液100 μL，靜置1 h，將其置于37℃恒溫培養箱中培養24 h，以0.45 μm除菌過濾的甲醇溶液作空白對照[22]。測量抑菌圈直徑，每組試驗重復3 次。

1.3.6 酚類單體的抑菌活性 分別稱取沒食子酸、香草酸、根皮酚、楊梅素、槲皮素、蘆丁、矢車菊素、矢車菊素－3 葡萄糖苷、飛燕草素、飛燕草素－3－葡萄糖苷標準品2 mg，溶于1 mL 甲醇溶液中，然后按照1.3.5 進行抑菌圈直徑測定，每組試驗重復3 次。

1.4 數據處理

數據采用平均值±標準偏差表示；采用SPSS 18.0軟件進行平均值、標準差及總酚、總黃酮、花色苷和單個酚類物質與抑菌活性的相關性統計分析，組間的平均值顯著性比較采用單因素ANOVA 方差分析及LSD多重比較，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同顏色蠶豆種皮提取液的總酚、總黃酮、花色苷含量

由表1可知，5 種不同顏色蠶豆種皮總酚含量存在顯著差異(P<0.05)，總酚含量介于165.94 ～ 8 487.62 mg·100g－1之間，其中紫紅蠶豆種皮的總酚含量最高，其次依次為黑蠶豆、陵西1 寸、2005－00，而青蠶18 號種皮含量最低。部分不同顏色蠶豆種皮間總黃酮含量存在顯著差異(P<0.05)，其中黑蠶豆種皮總黃酮含量最高，達到209.01 mg·100g－1，其他花色蠶豆種皮總黃酮含量從大到小依次為紫紅蠶豆、陵西1 寸、2005－00 和青蠶18 號。部分不同顏色蠶豆種皮間花色苷含量存在顯著差異(P<0.05)，其中紫紅蠶豆種皮花色苷含量最高，為65.64 mg·100g－1，其次為黑蠶豆，達到61.06 mg·100g－1，其余3 種蠶豆種皮花色苷含量相對較低，且三者間無顯著差異。綜上，紫紅蠶豆種皮總酚、花色苷含量最高，黑蠶豆總黃酮含量最高。蠶豆種皮顏色較深的品種(黑蠶豆、紫紅蠶豆)總酚、總黃酮及花色苷含量顯著高于其他蠶豆品系，而種皮顏色較淺的品種(青蠶18 號)總酚、總黃酮、花色苷最低。

表1 蠶豆種皮中總酚、總黃酮和花色苷含量Table 1 Contents of total phenols，total flavonoids and anthocyanins in seed coats of faba beans/(mg·100g－1)

2.2 不同顏色蠶豆種皮提取液的酚類物質的組成及含量

表2中酚類物質組成測定采用購置的多個標準品進行LC-MS/MS 分析，而表1應用沒食子酸標品采用分光光度計法進行測定，因標準品限制及測定方法原理的不同，酚類物質數據與表1存在差距。由表2可知，沒食子酸、原兒茶酸為蠶豆種皮中的主要酚酸物質，兒茶素、楊梅素、根皮素和槲皮素為主要黃酮類物質，其中沒食子酸(9.50 μg·g－1)、楊梅素(67.18 μg·g－1)、根皮素(8.98 μg·g－1)、槲皮素(20.86 μg·g－1)含量均在紫紅蠶豆種皮中最高，其次是黑蠶豆，而青蠶18 號蠶豆純白色種皮中兒茶素(0.04 μg·g－1)、沒食子酸(0.11 μg·g－1)、楊梅素(0.25 μg·g－1)均最低；另外，陵西1寸蠶豆種皮的兒茶素含量與黑蠶豆種皮無顯著差異，但其沒食子酸、楊梅素、根皮素均顯著低于紫紅蠶豆和黑蠶豆，高于青蠶18 號和2005－00。Luthria 等[23]通過對15 種干食用豆中酚酸含量進行測定，發現阿魏酸是所有大豆品種中的主要酚酸物質，且阿魏酸的含量為17.8 mg·100g－1左右，而本研究結果中阿魏酸含量為0.01～0.08 μg·g－1，出現上述差異的原因可能是本研究試驗對象為種皮。王何柱等[24]通過對7 種不同花色的蕓豆種皮進行酚類物質分析發現，蕓豆種皮中的主要酚類化合物為沒食子酸、綠原酸、兒茶素、3，4－二羥基苯甲酸和對羥基苯甲酸，且黑種皮及紫紅種皮蕓豆的酚類物質含量較高。該結果與本研究結果中主要酚類物質略有不同，這可能是由于不同豆類品種間存在差異，但研究結果都發現黑色及紫紅色種皮酚類物質含量較高。

表2 5 種不同顏色蠶豆種皮酚類物質的組成及含量Table 2 Compositions and contents of phenolic compounds in five seed coasts of faba beans with different colores/(μg·g－1)

由表2還可知，矢車菊素、矢車菊素－3－葡萄糖苷、飛燕草素和飛燕草素－3－葡萄糖苷為蠶豆種皮中的主要花色苷類物質，其中矢車菊素、矢車菊素、矢車菊素－3－葡萄糖苷、飛燕草素和飛燕草素－3－葡萄糖苷最高含量均存在于黑蠶豆種皮中，其含量分別為2.84、1.04、4.60、2.07 μg·g－1，其次為紫紅蠶豆，而青蠶18 號純白色種皮中矢車菊素(0.02 μg·g－1)、飛燕草素(0.09 μg·g－1)含量最低。

另外，根據表2可知，5 種不同顏色蠶豆種皮的酚類物質總和、黃酮物質總和及花色苷物質總和存在顯著差異，酚類物質總和大小均依次為紫紅蠶豆(紫紅)>黑蠶豆(黑)>陵西1 寸(綠)>2005－00(灰)>青蠶18號(純白)；酚酸、黃酮物質總和大小依次為紫紅蠶豆(紫紅)>黑蠶豆(黑)>陵西1 寸(綠)>2005－00(灰)>青蠶18 號(純白)；花色苷物質總和大小依次為黑蠶豆(黑)>紫紅蠶豆(紫紅)>陵西1 寸(綠)>2005－00(灰)>青蠶18 號(純白)。其中紫紅蠶豆種皮的酚類物質總和及黃酮物質總和最高，分別為150.42、127.58 μg·g－1；黑蠶豆種皮的花色苷物質總和最高，為10.61 μg·g－1，而青蠶18 號酚類物質總和、酚酸物質總和、黃酮物質總和及花色苷物質總和均較低，其值分別為4.84、0.81、3.73、0.31 μg·g－1。綜上，蠶豆種皮顏色與酚類物質組成及含量間存在相關性，且深色蠶豆種皮中有更多的酚類物質含量。

2.3 不同顏色蠶豆種皮提取液的抑菌活性

由圖2可知，5 種不同顏色蠶豆種皮提取液均能抑制大腸桿菌活性，抑菌圈直徑在15.67～18.00 mm之間，其中陵西1 寸、黑蠶豆、紫紅蠶豆和2005－00 蠶豆種皮提取液抑菌活性較高，但無顯著差異，而青蠶18 號種皮提取液表現出相對較弱的抑菌作用，其抑菌圈直徑僅為15.67 mm。由圖3可知，5 種蠶豆種皮提取液對金黃色葡萄球菌均有抑制作用，其抑菌圈直徑在15.13～19.80 mm 之間，黑蠶豆、青蠶18 號和2005－00 抑菌活性較高，其抑菌圈直徑分別為19.47、19.80 和19.13 mm，而陵西1 寸蠶豆種皮提取液對金黃色葡萄球菌抑制作用相對較弱，其抑菌圈直徑僅為15.13 mm。由圖4可知，5 種蠶豆種皮提取液均具有抑制沙門氏菌活性的作用，抑菌圈直徑在13.47～16.80 mm 之間，其中陵西1 寸、黑蠶豆和紫紅蠶豆種皮提取液對沙門氏菌抑制作用相對較強，其抑菌圈直徑分別為15.47、16.80 和16.47 mm，而青蠶18 號和2005－00 的蠶豆種皮提取液抑菌作用最弱。說明不同顏色蠶豆種皮提取液對不同菌種的抑制作用不同，其中深色蠶豆種皮對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌能力較強，而淺色蠶豆種皮抑菌作用相對較弱。

圖2 蠶豆種皮提取液對大腸桿菌抑菌活性的影響Fig.2 Effects of the extract of faba bean seed coats on the antibacterial activity of Escherichia coli

圖3 蠶豆種皮提取液對金黃色葡萄球菌抑菌活性的影響Fig.3 Effects of the extract of faba bean seed coats on the antibacterial activity of Staphylococcus aureus

圖4 蠶豆種皮提取液對沙門氏菌抑菌活性的影響Fig.4 Effects of the extract of faba bean seed coats on the antibacterial activity of Salmonella

2.4 相關性分析

由表3可知，總酚、總黃酮含量與沙門氏菌抑菌活性呈顯著正相關(P<0.05)，而花色苷含量與大腸桿菌抑菌活性呈顯著正相關(P<0.05)。單個酚類物質中沒食子酸、楊梅素、根皮素、原兒茶酸、香草酸及飛燕草素－3－葡萄糖苷含量與大腸桿菌抑菌活性呈極顯著正相關(P<0.01)，而槲皮素、矢車菊素、矢車菊素－3－葡萄糖苷及飛燕草素含量與大腸桿菌抑菌活性呈顯著正相關(P<0.05)；另外，矢車菊素含量與沙門氏菌抑菌活性呈顯著正相關(P<0.05)。說明蠶豆種皮中不同酚類單體含量與其抑菌活性之間均存在一定的關系，不同的單體在抑菌活性方面存在一定的協調作用。

表3 總酚、總黃酮、花色苷和單個酚類物質與抑菌活性的相關性Table 3 Correlations of antioxidant activity with total phenolics，total flavonoids，anthocyanins and individual phenolic acids

由表4可知，酚類物質單體成分對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌均具有抑制作用。酚酸及黃酮類物質中沒食子酸、楊梅素、蘆丁對大腸桿菌的抑制作用較強，其抑菌圈直徑在13.13～13.80 mm 之間，其抑菌活性無顯著差異；沒食子酸、蘆丁對金黃色葡萄球菌的抑制作用較強，其抑菌圈直徑分別為13.80 和14.47 mm；而酚酸及黃酮類物質中單體成分對沙門氏菌均有抑制作用，其抑菌活性無顯著差異。

表4 酚類物質單體的抑菌圈結果Table 4 Results of bacteriostasis of phenolic monomers

花色苷類單體成分對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均具有較強的抑菌作用，其花色苷類單體成分間抑菌活性無顯著差異；而矢車菊素對沙門氏菌的抑制作用最強，其抑菌圈直徑最大為13.13 mm，其余參試花色苷類單體成分對沙門氏菌的抑制作用相對較弱，且無顯著差異。說明酚類物質單體成分對供試菌種的抑菌活性不同，其中沒食子酸、蘆丁及矢車菊素對供試菌種抑菌作用均較強，且蠶豆種皮中酚酸及黃酮類物質單體以兒茶素、沒食子酸為主，花色苷物質以矢車菊素為主，進一步說明沒食子酸及矢車菊素在抑菌活性中起重要作用，是發揮抑菌作用的主要物質。

3 討論

本研究結果表明，5 種不同顏色蠶豆種皮的總酚、總黃酮及花色苷含量存在差異，其中蠶豆種皮顏色較深的品種(黑蠶豆、紫紅蠶豆)總酚、總黃酮及花色苷含量顯著高于其他蠶豆品系，而種皮顏色較淺的品種——青蠶18 號的總酚、總黃酮、花色苷較低。Xu等[25]發現黑色種皮蕓豆中的酚類物質含量明顯高于其他顏色豆類；Kim 等[26]發現，棕色和黑色種皮大豆的酚類物質含量顯著高于黃、綠種皮大豆，表明酚類化合物的含量與種皮顏色之間存在相關性；Giusti 等[27]研究扁豆、鷹嘴豆、豌豆及大豆中多酚含量與豆子顏色及生物活性關系，結果發現深色豆類的總酚含量更高，該結果與本研究結果基本一致。因此，深色蠶豆種皮具有較高的酚類物質含量及組成，可以根據該特點為不同顏色蠶豆種皮選擇適宜的加工利用方式。

另外，本研究發現深色蠶豆種皮對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌能力較強，而淺色蠶豆種皮抑菌作用相對較弱。相關性分析結果也表明，總酚、總黃酮含量與沙門氏菌抑菌活性呈顯著正相關，而花色苷含量與大腸桿菌抑菌活性呈顯著正相關，說明酚類物質含量是影響抑菌活性的關鍵因素之一。Gan 等[28]研究了28種有色食用豆種皮提取物中酚類的成分，表明有色豆種皮富含多酚類且具有較強抗氧化性和抑菌作用。Wang 等[29]研究表明，抗菌活性與酚含量之間存在較強相關性。同時，在酚類物質單體抑菌活性的相關分析及研究中發現，蠶豆中酚酸及黃酮類物質單體以兒茶素、沒食子酸為主，花色苷類物質以矢車菊素為主，說明沒食子酸及矢車菊素在抑菌活性中起重要作用，而深色蠶豆種皮兒茶素、沒食子酸和矢車菊素含量較高，說明深色蠶豆種皮抑菌活性較強，可作為天然多酚抑菌劑的功能原料。

目前，已有研究學者針對少數單體酚類物質進行了抑菌活性研究。張雅麗等[30]的體外抑菌研究表明，沒食子酸對常見食源性致病菌和腐敗菌均有抑制作用。曾亮[31]研究發現，兒茶素對鴨肉中常見菌如假單胞菌、大腸桿菌、李斯特氏菌、葡萄球菌與乳酸菌均具有很好的抑制作用。而本研究表明酚類單體中沒食子酸、兒茶素及矢車菊素對供試菌種抑菌作用均較強，是發揮抑菌作用的主要物質，這與前人研究結果一致。后續可以對蠶豆種皮提取液及酚類單體成分的抑菌濃度進行研究，同時考慮其他陽性對照進行抑菌活性比較研究，進一步探究蠶豆種皮酚類物質發揮抑菌作用的物質基礎，為其綜合應用奠定基礎。

4 結論

本研究結果表明，5 種不同顏色蠶豆種皮中酚類物質存在一定差異，蠶豆種皮顏色較深的品種(黑蠶豆、紫紅蠶豆)總酚、總黃酮及花色苷含量顯著高于其他蠶豆品系。沒食子酸和原兒茶酸為蠶豆種皮中的主要酚酸物質，兒茶素、楊梅素、根皮素及槲皮素為主要的黃酮類物質，矢車菊素、矢車菊素－3－葡萄糖苷、飛燕草素和飛燕草素－3－葡萄糖苷為主要花色苷類物質，且深色蠶豆種皮具有較高酚類物質含量及組成。不同顏色蠶豆皮抑菌活性與酚類物質含量存在顯著正相關，其中沒食子酸及矢車菊素在抑菌活性中起重要作用。綜上，深色蠶豆種皮含有豐富的酚類化合物，且具有較高的抑菌活性。