壯族冠心病患者的TLR4表達水平及其rs4986790A/G、rs4986791C/T位點的多態性分析▲

周柳芳 黃達 黃照河 劉燕 周柳平 何斌 劉文靜

右江民族醫學院附屬醫院心血管內科，廣西百色市 533000

冠心病(Coronary Heart Disease，CHD)尤其是急性冠脈綜合征(Acute Coronary Syndrome，ACS)是目前危害人類健康的最主要疾病之一，而后者是心血管疾病的急危重癥之一。目前認為，CHD慢性炎癥是導致患者冠狀動脈粥樣硬化最重要的機制，其中Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)[1]、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)[2]、白細胞介素(Interleukin，IL)[3]等介導的炎癥反應在CHD的發生、發展中起關鍵作用[4-5]。研究發現，Toll樣受體蛋白家族中的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點的多態性與CHD的發病密切相關，但在不同區域、不同種族人群間存在巨大差別。本研究就廣西壯族CHD患者的TLR4蛋白表達水平及其rs4986790A/G、rs4986791C/T位點的基因多態性與CHD發病的關系進行研究，旨為評估不同人群CHD的發病風險及患者的靶向治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月至2018年1月在我院行冠狀動脈造影(CAG)檢查被確診為CHD的壯族患者245例為CHD組，選取同期在我院住院治療的非CHD壯族患者245例為對照組。納入標準：(1)CHD組患者經冠狀動脈造影(CAG)檢查確診，對照組患者根據臨床表現及B超等相關檢查確診(其中高血壓患者98例、糖尿病患者103例、其他疾病44例)；(2)壯族，患者及其三代及以上直系親屬均出生并長期居住于廣西地區，三代及以上無與外族通婚情況；(3)患者彼此間無血緣關系；(4)患者及其家屬簽署檢測研究知情同意書。排除標準[6-7]：(1)嚴重感染、惡性腫瘤、罹患嚴重肝腎疾病；(2)合并其他心臟疾病如先天性心臟病、酒精性心肌病、心臟瓣膜病及擴張型心肌病等；(3)曾接受再灌注治療。兩組患者的性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。本研究嚴格按照國家人類基因組研究倫理學準則和赫爾辛基宣言進行，并得到右江民族醫學院附屬醫院醫學倫理委員會審查批準。

表1 兩組患者的一般資料比較 [ n(%)，x±s ]

1.2 外周血血清TLR4蛋白表達水平檢測 于早晨6:00至7:00抽取研究對象空腹靜脈血5～10 mL，離心后留取上層血清，置于-20℃冰箱保存備用，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)(試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司)檢測兩組患者外周血血清TLR4蛋白表達水平。

1.3 外周血TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點多態性檢測 研究對象采血前夜22:00后禁食，次日早晨6:00至7:00抽取空腹靜脈血約2 mL置于EDTA抗凝管內。(1)采用DNA血液提取試劑盒提取外周血DNA，置于-80℃冰箱保存備用(試劑盒購自北京天根生化科技有限公司)。(2) 采用PCR技術擴增目的基因片段，TLR4基因rs4986790A/G和rs4986791C/T序列來自NCBI GenBank，引物采用Primer3軟件設計，由上海生工生物工程股份有限公司合成。TLR4基因rs4986790A/G上游引物：5′-TCCATCGTTTGGTTCTGGGAGA-3′，下游引物：5′-TCACACTCACCAGGGAAAATGAAGA-3′；rs4986791C/T上游引物：5′-CCAACAAAGGTGGGAATGCTTTT-3′，下游引物：5′- TGCTGGAAATCCAGATGTTCTAGTTG-3′。10 μL PCR反應體系：1GC-I buffer，3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP，1 U HotStarTaq polymerase，1 μL樣本DNA和1 μL多重PCR引物。PCR循環程序：95℃預變性 2 min，94℃變性20 s，65℃退火40 s，72℃延伸1.5 min，重復11個循環；之后94℃變性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，重復24個循環；72℃延伸2 min，產物置于4℃冰箱保存備用。取10 μL PCR產物，加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶純化后進行PCR擴增。(3)取0.5 μL純化后的延伸產物上ABI3730XL測序儀，采用GeneMapper 4.1 (AppliedBiosystems Co.，Ltd.，USA) 分析軟件進行分析(由上海天昊生物科技有限公司協助完成)。

1.4 統計學處理 采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析。計數資料用%表示，組間比較采用χ2檢驗；正態分布的計量資料用x±s表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組患者的血清TLR4蛋白表達水平比較 CHD組患者、對照組患者的血清TLR4蛋白平表達水平分別為(4.24±1.54)ng/mL和(1.07±0.43)ng/mL，兩組比較差異有統計學意義(t′=31.033，P<0.05)。見圖1。

圖1 CHD組患者和對照組患者血清TLR4蛋白表達水平的散點柱狀圖

2.2 兩組患者外周血TLR4基因rs4986790A/G位點的多態性分布情況比較 CHD組患者、對照組患者TLR4基因rs4986790A/G位點的等位基因均為野生型A，未見突變型G；兩組患者TLR4基因rs4986790A/G位點的基因型均為 AA純合子。見圖2。CHD組患者與對照組患者TLR4基因rs4986790A/G位點的等位基因及基因型頻率分布比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

圖2 患者外周血TLR4基因rs4986790A/G位點測序圖

表2 兩組患者外周血TLR4基因rs4986790A/G位點的多態性分布情況比較

2.3 兩組患者外周血TLR4基因rs4986791C/T位點的多態性分布比較 在CHD組和對照組490例患者中，在TLR4基因rs4986791C/T位點僅檢測到1例突變型T，基因型為CT雜合子(對照組患者)，其余489例患者的基因型均為野生型C。見圖3。CHD組患者與對照組患者TLR4基因rs4986791C/T位點的等位基因及基因型頻率分布比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

圖3 患者外周血TLR4基因rs4986791C/T位點測序圖

表3 兩組患者外周血TLR4基因rs4986791C/T位點的多態性分布情況比較

2.4 不同地區人群TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點的多態性分布情況比較 與人類基因組計劃(Hapmap)公布的非洲人、歐洲人、日本人、印度人、北京人的TLR4基因多態性頻率分布的數據(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)比較發現，中國廣西壯族、中國北京、日本、歐洲、非洲、印度人群TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點的基因型及等位基因的分布情況比較。見表4、表5。

表4 不同地區人群TLR4基因rs4986790A/G位點的基因型及等位基因分布情況比較 [n(%)]

表5 不同地區人群TLR4基因rs4986791C/T位點的基因型及等位基因分布情況比較 [ n(%)]

3 討 論

TLRs是模式識別受體家族的重要成員之一，能特異性識別病原相關的分子模式 (PAMPs)，誘導炎性介質、趨化細胞因子、刺激分子的表達上調，促進炎癥介質的合成和釋放等一系列級聯免疫炎性反應，參與感染、內分泌代謝疾病、自身免疫性疾病、腫瘤、動脈粥樣硬化等多種疾病的發生發展過程[8-10]。動脈粥樣硬化是一種慢性炎性疾病，TLR4作為機體免疫炎癥反應中重要的一環，可通過誘導機體產生IL、TNF等多種生物活性因子，造成血管內皮細胞損傷、血管平滑肌細胞增生及成纖維細胞浸潤，介導及加速動脈粥樣硬化(AS)的形成及發展，導致冠心病(CHD)發生[11-12]。

TLR4基因有多個位點(如rs11536889、rs1927911、rs4986790、rs4986791、rs752998、rs2149356等)，與感染、腫瘤、炎癥性腸病、心血管疾病等多種疾病的發生存在關聯[13-16]。Guven等[17]報道，土耳其人TLR4基因rs4986790、rs4986791位點的多態性與CHD的發病無明顯關系；Ameziane等[18-19]研究發現，rs4986790位點的多態性與AS、急性冠狀動脈綜合征(ACS)等缺血性心血管病的發病相關，突變型G等位基因能降低缺血性心血管病的發生風險。李順東等[20-21]報道，rs4986791位點的多態性與CHD的發病易感性相關，在CHD患者中野生型C等位基因頻率較高。Di Nisio等[22]報道，TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點突變等位基因攜帶者的膽固醇水平低于不攜帶者，AS、CHD等心血管疾病的發生風險較低，可能是AS、CHD發生發展的保護因素。

本研究結果顯示，CHD組患者的血清TLR4蛋白表達水平明顯高于對照組，提示TLR4基因與廣西壯族人群CHD發病有明顯相關性。本研究中490例患者TLR4基因rs4986790A/G位點的等位基因均為野生型A，未見突變型G，基因型均為AA純合子；在TLR4基因rs4986791C/T位點僅檢測到1例突變型T等位基因，基因型為CT雜合子(對照組患者)，其余489例患者的基因型均為CC純合子，兩組患者的rs4986790A/G、rs4986791C/T位點的基因型和等位基因分布情況比較差異無統計學意義，提示廣西地區壯族人群TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點突變的可能較為罕見，TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點與壯族人群CHD發病易感性的相關性可能較弱。通過對比分析發現，中國廣西、中國北京、日本、歐洲、非洲、印度人群的TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點的基因型及等位基因分布比較，差異有統計學意義，提示TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點的多態性分布情況在不同地區及不同人群中存在較大的差異。

綜上所述，廣西壯族人群外周血TLR4的表達水平與CHD患者的發病存在關聯，但TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點的多態性可能與壯族人群CHD發病無明顯的相關性。不同地區、不同種族人群TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點的多態性分布情況存在顯著差異。