貝萊斯芽孢桿菌zk1對鷹嘴桃果肉組織的影響及酶學特性

陳少先 - 劉 悅 曾瑤英 - 余 倩

(仲愷農業工程學院食品學院，廣東 廣州 510225)

貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)的一個亞種，是革蘭氏陽性好氧細菌，菌體成桿狀，內生孢子，在自然界中廣泛分布[1]。近年來，貝萊斯芽孢桿菌主要作為生防菌在報道，國內外相關研究大多集中在促進動植物生長、拮抗病原菌、誘導系統抗性、抑菌物質及其基因簇鑒定、拮抗作用機制等方面[2-5]，在抑制病原菌和生物防治方面具有顯著優點。實驗室在腐敗的鷹嘴桃中分離并鑒定出一株貝萊斯芽孢桿菌，將其命名為貝萊斯芽孢桿菌zk1(Bacillusvelezensiszk1)，該菌對鷹嘴桃的致腐能力極強，而關于貝萊斯芽孢桿菌作為腐敗菌的報道極少。

果蔬的腐爛通常是由病原菌分泌的細胞壁降解酶[6]通過對細胞壁間多糖物質降解，破壞細胞結構，使果實軟化，引起致腐。宋喜霞[7]判斷果膠甲基反式消除酶和多聚半乳糖醛酸酶在銹腐菌侵染人參過程中起了重要作用；李寶聚等[8]證明果膠酶、纖維素酶在黃瓜黑星病菌致病中起著重要作用，是主要的致病因子之一；也有文獻[9]報道灰葡萄孢菌株的致病力與β-葡聚糖苷酶具有相關性；李喜玲[10]證明了灰葡萄孢菌株的致病力與纖維素酶活力呈正相關，灰霉菌果膠酶活力高低與致病力強弱有一定的相關性。以上研究都表明了腐敗菌分泌的酶類是侵染宿主的關鍵致病因子，此外，病原菌在侵入宿主初期會遇到細胞壁屏障，病原菌釋放細胞壁降解酶，從而有利于其入侵，也為其他微生物的入侵提供便利，加速寄主的腐敗。

國內外對核果果實采后病害的病理生理和采后病害控制技術方面已經做了大量的研究[11-12]，但對降解細胞壁酶類的酶學性質研究較少，且在關于貝萊斯芽孢桿菌對水果的致腐作用目前尚未報道。研究擬檢測菌株Bacillusvelezensiszk1致病后導致鷹嘴桃成分和果肉超微結構的變化，有針對性地開展其中相關酶的酶學特性研究，以期得到該菌株中與植物致病相關酶的最適反應溫度、pH值和金屬離子信息，為進一步解釋其致病的機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貝萊斯芽孢桿菌zk1(Bacillusvelezensiszk1，zk1)：中國普通微生物菌種保藏管理中心；

鷹嘴桃：廣東省河源市連平縣三角湖果園；

營養瓊脂(NA)和營養肉湯(NB)：青島海博生物技術有限公司；

木聚糖：分析純，美國Sigma試劑公司；

無水葡萄糖、半乳糖醛、D-木糖、淀粉、羧甲基纖維素鈉等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗試劑和儀器

生化培養箱：SPX-150型，上海悅豐儀器儀表有限公司；

立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋：LX-C35L型，合肥華泰醫療設備有限公司；

高速冷凍離心機：H2500R-2型，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；

凍干機：HX-18型，上海滬析實業有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-IF型，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；

電熱恒溫干燥箱：DHG-942D0A型，浙江賽德儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌懸液制備 貝萊斯芽孢桿菌zk1先用營養瓊脂培養基復活，再用營養肉湯培養液在37 ℃、120 r/min震蕩培養24 h，傳代兩次，比濁法調整菌數為104CFU/mL。

1.3.2 鷹嘴桃的成分檢測

(1) 樣品前處理：挑選同一批次的健康鷹嘴桃，采用菌液刺傷接種法，在赤道部位接種6個點/果，常溫保濕(RH≥85%)培養48 h。用無菌刀具削取每果赤道部位組織(帶果皮)，修切成10 mm×10 mm×10 mm的小方塊，冷凍干燥72 h，打粉(2 800 r/min，5 min)，過60目篩備用。以注射無菌蒸餾水的鷹嘴桃為對照組。

(2) 成分檢測：淀粉含量按GB 5009.9—2016的酸水解法執行；纖維素、半纖維素和果膠含量按NY/T 3165—2017的濾紙袋法執行。

1.3.3 貝萊斯芽孢桿菌zk1致病鷹嘴桃的透射電鏡(TEM)觀察 用菌液刺傷感染的方式，將菌株zk1接種到健康的鷹嘴桃，噴無菌蒸餾水保濕，37 ℃培養24 h。然后在超凈工作臺切取病健交接部位的組織，用刀片修整為1 mm×1 mm×3 mm的樣品塊，整個取樣過程不超過2 min，即刻放入含2.5%戊二醛的磷酸—檸檬酸緩沖液溶液(pH 7.4)固定24 h。對照組用無菌蒸餾水接種健康鷹嘴桃果實并在同樣條件下培養，參照病果的取樣部位，切取對照組的桃果肉組織樣品。

按照常規TEM樣品制備方法[13]略作改動。1%四氧化鋨將待測樣品塊固定6 h，含2.5%戊二醛的磷酸—檸檬酸、酸緩沖液溶液(pH 7.4)漂洗2 h，用30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%乙醇浸泡10 min進行梯度脫水，氧化丙稀和丙稀環氧樹脂稀釋液浸透，Epon812包埋；超薄切片機定位并切成70～100 nm超薄切片。然后用檸檬酸鉛和醋酸鈾電子染色，最后用透射電鏡觀察。

1.3.4 標準曲線制作 淀粉酶活測定采用YOO改良法[14]；果膠酶活力測定參照文獻[15]；纖維素酶活力測定按GB/T 23881—2009執行；木聚糖酶活力測定按GB/T 23874—2009執行。以每分鐘降解底物釋放1 μmol葡萄糖(或D-半乳糖醛酸、木糖)所需的酶量定義為一個酶活單位(U)。

根據以上方法制作標曲。葡萄糖標準曲線線性回歸方程為y=12.46x+0.248 4，R2=0.996 7；半乳糖醛酸標準曲線線性回歸方程為y=1.463x+0.072 9，R2=0.997 4；木糖標準曲線線性回歸方程為y=1.579x+0.067 8，R2=0.998 3。

1.3.5 粗酶液制備及酶活力測定 吸取1 mL菌懸液加入100 mL含有1.00 g淀粉的營養肉湯培養基，37 ℃，120 r/min震蕩培養12 h，誘導菌在培養基中產酶。5 000 r/min離心20 min后得到的上清液即為淀粉酶粗酶液。4 ℃保存備用，在48 h內使用。將淀粉分別替換成羧甲基纖維素鈉、果膠、木聚糖，制得纖維素酶粗酶液、果膠酶粗酶液、木聚糖酶粗酶液。

試驗前先將待測粗酶液、底物溶液(1.0 g/100 mL)于37 ℃預熱10 min。在25 mL具塞比色管中依次加入1 mL 底物溶液、1 mL檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖液、0.5 mL 粗酶液和1.5 mL去離子水，振蕩3～5 s。于40 ℃ 水浴鍋水浴30 min，再加入2 mL DNS試劑終止反應，沸水浴10 min，立刻用水冷卻至室溫，加水定容至25 mL。在540 nm處測定吸光值A1。每個試樣進行3次平行試驗，結果取平均值，保留3位有效數字。淀粉酶活性的測定底物為1%淀粉溶液，纖維素酶活性的測定底物為1%羧甲基纖維素鈉溶液，果膠酶活性的測定底物為1%果膠溶液，木聚糖酶活性的測定底物為1%木聚糖溶液。

空白測定：粗酶液沸水浴滅活5 min，其余步驟同上，吸光值記為A0。

淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶酶活性按式(1)計算：

(1)

式中：

X——粗酶液的酶活力，U/mL；

A1——粗酶液反應的吸光值；

A0——空白樣反應的吸光值；

K——標準曲線的斜率；

C0——標準曲線的截距；

t——酶解反應時間，min；

M——摩爾質量。

1.3.6 貝萊斯芽孢桿菌zk1酶學性質研究

(1) 酶促反應最適溫度：在pH 5.0的條件下，將粗酶液與檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖液混合，分別以30，40，50，60，70，80，90 ℃為反應溫度，反應30 min，測定相應的酶活力。每處理做3個平行，取平均值計算酶活數值，最高酶活力值記為100%，計算出各溫度下的酶活力。

(2) 酶促反應最適pH值：在最適溫度條件下，將粗酶液分別與用pH 3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0的緩沖劑調配的底物混合，作用30 min，測定相應的酶活力，每處理做3個平行，取平均值計算酶活數值，以酶活力最高值為100%，計算各個pH條件下的酶活力。

(3) 金屬離子對酶活性的影響：參照崔海洋等[16]的方法并略作修改，在最適溫度和pH條件下，在粗酶液中分別加入0.15 mmol/L金屬離子(Na+、K+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Fe2+、Ba2+、Mg2+)化合物、氯化物及硫酸鹽，測定相應的酶活力，每處理做3個平行，取平均值計算酶活數值，以未添加金屬離子的粗酶液酶活數值為100%，計算各金屬離子下的酶活力。

2 結果與分析

2.1 鷹嘴桃成分檢測

在植物體內，質體中包含的淀粉粒是多糖的主要貯藏形式，先前有研究[17]發現桃果肉細胞中淀粉粒還存在于細胞間隙。而果膠會與半纖維素、纖維素形成交聯結構，起到維持細胞骨架形態的作用[18]。由圖1可知，鷹嘴桃被菌株zk1侵染后，果實中的淀粉、纖維素、半纖維素和果膠含量都出現了一定程度的減少，推測菌株zk1具備較強的糖苷水解和多糖裂解能力。以鷹嘴桃果肉為營養來源時，該菌在生長過程中逐漸產生相關酶類，用來消耗培養環境中的淀粉、纖維素、半纖維素和果膠等營養物質。當其附著在鷹嘴桃等水果表面，與之接觸的部位就成為了營養供給體，接觸部位的果肉組織隨著營養物質的消耗而逐漸坍塌腐爛，最終果肉大面積腐敗。

2.2 貝萊斯芽孢桿菌zk1致病鷹嘴桃的掃描電鏡觀察結果

如圖2(a)所示，鷹嘴桃接種無菌水培養24 h后，果肉組織結構未受到破壞，果肉細胞完整，排列整齊。細胞之間有小間隙，大液泡占據細胞內部的主要面積，其余細胞器被液泡擠到邊緣，豐富的細胞內含物緊靠細胞壁分布。果肉細胞壁緊密，細胞壁之間的中膠層是高密度的結構，細胞壁與中膠層在透射電鏡下成像明暗分明，可清楚辨別。液泡膜將液泡和其他細胞內含物隔開，靠近細胞壁的細胞內含物中包括了葉綠體、線粒體、質體和淀粉顆粒。所有細胞內含物均保持了正常的形態。葉綠體為兩端較尖長條形細胞器，長度約1 μm。線粒體是圓形的細胞器，可以看到其內有突起嵴。

如圖2(b)所示，鷹嘴桃果肉被菌株zk1侵染后，果肉組織則遭到了嚴重的損壞。細胞壁致密性降低，部分結構降解導致細胞整體結構松散，細胞壁與中膠層之間的明暗對比度淡化。中膠層溶解并與細胞壁剝離，細胞間隙加大，細胞壁出現漂移。部分細胞壁彎曲，細胞內含物進入細胞壁，相鄰的細胞之間的聚合度明顯下降。細胞器已出現降解，細胞壁空腔化，葉綠體與線粒體發生變形，大部分線粒體破裂，葉綠體片層結構不清晰。液泡膜消失，液泡與質體互溶。大淀粉顆粒被分解成零散小顆粒。

圖1 鷹嘴桃成分檢測結果

從圖2可以看出，細菌zk1對鷹嘴桃的細胞有極強的破壞能力，可以在短短的24 h內將健康的鷹嘴桃果肉組織瓦解。病變果肉細胞具體表現為細胞壁、中膠層、淀粉顆粒等細胞內含物和結構組織的損壞。細胞壁中存在木聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯聚糖等聚多糖[19]30-33，果膠和纖維素分別是中膠層和微纖絲的主要成分[20-21]，結合鷹嘴桃被侵染前后的成分檢測，推測細菌zk1應該具有分解這些成分的能力。

2.3 酶學性質

2.3.1 酶促反應最適溫度 如圖3所示，菌株zk1能針對不同的外源誘導物產生相應的酶(粗酶液)，且這些酶對溫度的適應能力不同。木聚糖酶在40 ℃下的相對酶活數值為0.036 1 U/mL。果膠酶的最適溫度為50 ℃，達到0.102 U/mL。反應溫度為60 ℃時，纖維素酶和淀粉酶的相對酶活力最優，分別為0.831 0，0.336 2 U/mL。由此可見，此菌株在較高的反應溫度條件下，纖維素酶和淀粉酶依然存活。半纖維素是植物細胞壁中廣泛存在的雜聚多糖，而木聚糖是半纖維素的主要組成部分[19]9。將菌株zk1接種鷹嘴桃后，主要是在37 ℃培養，接近試驗中的40 ℃。根據酶促反應最適溫度的結果，該菌株對鷹嘴桃的致病作用可能是依賴于木聚糖酶對桃果細胞壁中木聚糖的水解功能，從而破壞了桃果細胞壁的半纖維素結構網絡。值得注意的是，在40 ℃下，淀粉酶依然保持了較好的酶解能力，酶活力有0.694 6 U/mL。而此溫度下，纖維素酶的活力為0.294 6 U/mL，與一株擁有高效纖維素酶基因的枯草芽孢桿菌工程菌的酶活力檢測數值接近[22]。

CW. 細胞壁 CC. 細胞內含物 V. 液泡 ICS. 細胞間隙 P. 質體 M. 線粒體 Chl. 葉綠體 ML. 中膠層 S. 淀粉粒 T. 液泡膜

圖3 溫度對酶活性的影響

2.3.2 酶促反應最適pH值 如圖4所示，與最適溫度結果(圖3)類似的是，果膠酶對反應條件的變化最敏感。隨著外部反應條件因素的改變，果膠酶活力的變化幅度最大。與果膠酶的最適pH值一樣，纖維素酶的最適pH值亦為6。在最適pH值下，纖維素酶活力為0.248 3 U/mL，而果膠酶的活力為0.150 6 U/mL。淀粉酶在中性反應條件(pH 7)下有最高酶活力，達到0.458 7 U/mL。木聚糖酶則表現出偏向堿性條件(pH 8)的耐受能力，這與一些菌株的木聚糖酶學特性研究結果不同。孫超[23]研究發現，桔青霉的木聚糖酶最適pH為5.5。其中的原因除了菌株之間存在物種基因差異，還可能是因為研究的菌株zk1分泌的木聚糖酶具有獨特的酶結構。

2.3.3 金屬離子對酶活性的影響 如圖5所示，除了Mn2+外，其余金屬離子能促進淀粉酶的酶活力。同時，Mn2+也是纖維素酶的抑制劑。由此推測，菌株zk1所分泌的淀粉酶和纖維素酶具有相似的結構，Mn2+能通過與氨基酸分子—SH基結合，使酶分子失活或變性[24]。但對于果膠酶而言，Mn2+則是一種激活劑，可令其相對酶活力超過114%。這可能是因為金屬離子與酶分子氨基酸側鏈的氧原子相結合，通過穩定的鍵作用力增強了酶活性區域的構象結構，或者形成了酶與底物的復合體[25]。試驗中，不同的金屬離子并未對木聚糖酶的酶活力造成負面影響，但林小洪等[26]研究發現，Mn2+和Cu2+對木聚糖酶具有明顯的抑制作用；楊穎等[27]研究發現，Mn2+、Ba2+、Mg2+、Cu2+對來源于AT24的木聚糖酶具有激活作用，而對來源于AT22-2的木聚糖酶卻具有抑制作用，這可能與不同木聚糖酶的結構差異有關，具體機理還需要進一步的研究論證。

圖4 pH值對酶活性的影響

同一種酶的小寫字母不同表示鄧肯(D)法檢驗在P<0.05水平差異顯著

3 結論

貝萊斯芽孢桿菌zk1侵染鷹嘴桃后，鷹嘴桃果肉細胞結構被破壞，出現變形、細胞器破裂、溶解等現象。推測該菌通過分泌淀粉酶、纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶來降解鷹嘴桃的果皮的纖維素和果肉中的淀粉、果膠等，從而使鷹嘴桃腐爛。酶學特性研究的結果顯示該菌分泌的淀粉酶最適反應溫度為60 ℃，最適反應pH值是7，0.15 mmol/L 的Mn2+可抑制淀粉酶的活力；纖維素酶最適溫度為60 ℃，最適反應pH值是6，Mn2+也可對其起抑制作用；木聚糖酶最適反應溫度為40 ℃，最適反應pH值是8，多種金屬離子均是激活劑；果膠酶最適反應溫度為50 ℃，最適反應pH值是6，Mn2+對其激活效果最優。試驗探究了貝萊斯芽孢桿菌zk1對鷹嘴桃的致病機理及其酶學性質，但未具體掌握該菌株降解植物細胞壁時各種多糖水解酶的結構，之后的研究方向可以考慮在這些方面繼續挖掘。