火龍果果實(shí)甜菜苷類色素組成與分布

陽辛鳳

王 盼3,4

郭曉杰1,3

楊 磊3,4

李 瓊4

(1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，海南 海口 571101；2. 海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571101；3. 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南 海口 570000；4. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 海口 571101)

火龍果是多年生攀緣植物，主要來源于仙人掌科(Cactaceae)量天尺屬(Hylocereus)和蛇鞭柱屬(Selenicereus)[1-4]。火龍果果實(shí)的果肉和果皮依品種不同呈多種顏色，如紅色、白色、紫色、紫紅、粉色、紅白雙色、橙色、黃色等。依據(jù)果皮與果肉顏色，火龍果果實(shí)主要分為紅皮紅肉型(RR)、紅皮白肉型(RW)和黃皮白肉型(YW)3類。研究[5-8]表明火龍果果實(shí)的天然色素屬于甜菜苷類色素(Betalains，BLs)。BLs為含氮水溶性色素，主要分布于甜菜、莧菜、千日紅、仙人掌和火龍果等植物中[1,5,9]。依據(jù)結(jié)構(gòu)不同，BLs分為甜菜紅色素(BCs)和甜菜黃色素(BXs)兩大類[4,9]。已報(bào)道的BLs有80余種，其中BCs和BXs分別為 46,36種[10-12]。BLs具有廣泛的生物活性，如抗氧化[1,12]、抗炎[13-14]、抗焦慮[15-16]、心血管疾病預(yù)防等[17-19]。Dong等[8]從量天尺屬H.polyrhizus的RR及RW果實(shí)中共鑒定了23種BLs，Leticia等[16]從綠柱屬火龍果Stenocereuspruinosus果實(shí)的紅色果肉和橙色果肉及S.stellatus果實(shí)的紅色果肉和白色果肉中共鑒定了11種BLs。目前有關(guān)火龍果果實(shí)BLs組分構(gòu)成及其在果肉、果皮部位的分布特征的研究尚未見報(bào)道。研究擬采用超高效液相色譜飛行時間質(zhì)譜法對不同類型火龍果果實(shí)和不同部位(果肉、果皮)中的BLs進(jìn)行篩查和結(jié)構(gòu)確證，分析BLs的組分構(gòu)成與空間分布，為火龍果BLs天然色素資源和生物活性產(chǎn)物的加工利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟火龍果：金都一號(RR型)、越南白肉(RW型)、無刺黃龍(YW型)，市售；

甲醇、乙腈：質(zhì)譜純，德國默克公司；

甲酸：色譜純，美國Fisher公司；

鹽酸：分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜飛行時間質(zhì)譜儀：Triple TOF 5600+型，安裝有Analyst?TF 1.6 工作站、PeakView?2.0軟件，美國AB SCIEX公司；

電子天平：ME204型，感量0.1 mg，瑞士梅特勒—托利多公司；

電子天平：JJ500型，感量0.01 g，江蘇常熟市雙杰測試儀器廠；

冷凍干燥機(jī)：LGJ-10D型，北京四環(huán)起航科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 將火龍果果實(shí)果皮和果肉分離，切塊，勻漿，于-50 ℃冷凍干燥15 h，得凍干樣品。稱取果皮、果肉凍干樣品5.00 g，用50 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇水超聲提取2次，每次20 min，合并提取液。12 000 r/min離心10 min，收集上清液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10 mL左右，轉(zhuǎn)移到10mL容量瓶并定容。過0.22 μm微孔濾膜，待上機(jī)。

1.3.2 測試條件 Agilent Poroshell SBAq色譜柱 (2.1 mm×50 mm，2.7 μm)；流動相為0.1%甲酸水溶液(A)—乙腈 (B)，梯度洗脫：0～1 min，2% B；1～10 min，2%～30% B；10～17 min，30%～90% B；17～18 min，90%～2% B；18～20 min，2% B；流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL。ESI離子源，電噴霧正離子模式，離子源電壓5 500 V，離子源溫度550 ℃，霧化氣379 kPa， 輔助氣379 kPa，氣簾氣241 kPa，去簇電壓80 V，碰撞能量35 eV，能量擴(kuò)展±15 eV，TOF-MS掃描范圍80～1 200，Product Ion掃描范圍50～1 000。掃描方式為IDA模式，開啟動態(tài)背景扣除(DBS)。采用AB Sciex公司的CDS質(zhì)量校正系統(tǒng)在線校正。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 采取靶向檢索與非靶向檢索策略相結(jié)合進(jìn)行火龍果果實(shí)樣品中BLs的篩查與確證。

(1) 靶向檢索：通過查詢資料和PubChem、ChemSpider、Nist等數(shù)據(jù)庫信息，建立包含102個BLs組分及其生物合成前體物的列表，包括英文名稱、CAS號、分子結(jié)構(gòu)式、分子量、二級碎片離子質(zhì)荷比(m/z)等信息，將該列表導(dǎo)入PeakView軟件。Analyst軟件對樣品信息進(jìn)行采集，包括一級質(zhì)譜信息與二級碎片信息。采集的數(shù)據(jù)導(dǎo)入PeakView進(jìn)行檢索，依據(jù)測定相對分子質(zhì)量與理論精確相對分子質(zhì)量的偏差小于5×10-6的原則以及同位素匹配結(jié)果，確定各色譜峰的成分歸屬，并進(jìn)一步對二級碎片進(jìn)行分析，根據(jù)碎片離子信息推斷各色譜峰所對應(yīng)未知物的結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)樣品中BLs的篩查與確證。

(2) 非靶向檢索：采集的數(shù)據(jù)導(dǎo)入PeakView進(jìn)行非靶向檢索，對檢索結(jié)果進(jìn)行分析，如果色譜峰的精確質(zhì)量數(shù)與同位素偏差均小于5×10-6，且母離子被打碎生成的二級碎片離子有BLs的共有特征離子，如m/z551,389,345,507等，則初步判定該未知物屬于BLs類化合物，然后根據(jù)PeakView給出的分子式到PubChem、ChemSpider、Nist等數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 火龍果甜菜苷類色素組分構(gòu)成

由表1可知，3種類型火龍果果實(shí)的果肉、果皮中共鑒定了19種BLs組分，其中BCs和BXs分別為15,4種。15種BCs組分分別為：甜菜苷(betanin)、甜菜苷配基(betanidin)、莧菜紅苷(amaranthin)、丙二酰甜菜苷(phyllocactin)、脫羧丙二酰甜菜苷(decarboxylated phyllocactin)、apiosyl-betanin、2'-O-apiosylphyllocactin、新丙二酰甜菜苷(neophyllocactin)、脫羧新甜菜苷(decarboxylated neobetanin)、千日紅苷-III(gomphrenin-III)、6'-O-malonyl-2-descarboxylated-betanin、hylocerenin、2-decarboxylated hylocerenin、2'-(5''-O-E-feruloylapiosyl) betanin和bougainvillein-R-I。4種BXs 組分分別為：梨果仙人掌黃質(zhì)(indicaxanthin)、3-methoxytyramine-betaxanthin、苯丙氨酸—甜菜黃素[(S)-phenylalanine-betaxanthin]和亮氨酸—甜菜黃素[(S)-leucine-betaxanthin]。

2.2 甜菜紅色素的鑒定

BCs在ESI+模式下容易發(fā)生中性丟失，有脫羧([-44]+)、脫己糖基([-162]+)、脫丙二酰基([-86]+)、脫羧兼脫2個氫([-46]+)等，產(chǎn)生的二級碎片離子中，重要的共有特征離子為m/z551([betanin+H]+)、507([betanin+H-CO2]+)、389([betanidin+H]+)或([betanin+H-Glu]+)、345([betanidin+H-CO2]+)，m/z551,389,345,507可以作為推斷BCs組分的依據(jù)[8,10,20-22]。

表1 火龍果果實(shí)甜菜苷類色素的UPLC QTOF-MS/MS鑒定結(jié)果?

續(xù)表1

圖1 丙二酰甜菜苷MS2譜圖

2.3 甜菜黃色素的鑒定

BXs與BCs結(jié)構(gòu)的基本單元是甜菜醛氨酸(betalamic acid)，二者的離子化模式較為相似，BXs在ESI+模式下同樣容易發(fā)生中性丟失，常見的有脫羧([-44]+)、脫羧兼脫1個氫([-45]+)、脫羧兼脫2個氫([-46]+)、脫2個羧基([-88]+)、脫2個羧基兼2個氫([-90]+)、脫羥基([-17]+)、脫亞甲基([-14]+)、脫甲基([-15]+)等[8,10,20-22]。

圖2 丙二酰甜菜苷裂解途徑

圖3 梨果仙人掌黃質(zhì)MS2譜圖

2.4 甜菜苷類色素在不同類型果實(shí)與部位的分布特征

由圖5可知，3種類型火龍果果實(shí)中，RR果實(shí)中BLs種類最豐富，共鑒定了18種組分(15種BCs和3種BXs)，包括甜菜苷、甜菜苷配基、莧菜紅苷、丙二酰甜菜苷、脫羧丙二酰甜菜苷、apiosyl-betanin、2'-O-apiosylphyllocactin、新丙二酰甜菜苷、脫羧新甜菜苷、千日紅苷-III、6'-O-malonyl-2-descarboxylated-betanin、hylocerenin、2-de-carboxylated hylocerenin、2'-(5''-O-E-feruloylapiosyl) betanin、bougainvillein-R-I、梨果仙人掌黃質(zhì)、3-methoxytyramine-betaxanthin和苯丙氨酸—甜菜黃素；其次是RW果實(shí)，鑒定了9種組分(8種BCs和1種BXs)，包括甜菜苷、甜菜苷配基、丙二酰甜菜苷、脫羧丙二酰甜菜苷、apiosyl-betanin、2'-O-apiosylphyllocactin、千日紅苷-III、2-decarboxylated hylocerenin和3-methoxytyramine-betaxanthin；YW果實(shí)中未發(fā)現(xiàn)BCs，僅鑒定了1種BXs組分，為亮氨酸—甜菜黃素。

RR果實(shí)的果皮(RR-P)部位鑒定了BLs組分14種(13種BCs和1種BXs)，包括甜菜苷、甜菜苷配基、丙二酰甜菜苷、脫羧丙二酰甜菜苷、2'-O-apiosylphyllocactin、新丙二酰甜菜苷、脫羧新甜菜苷、千日紅苷-III、6'-O-mal-onyl-2-descarboxylated-betanin、hylocerenin、2-decarboxy-lated hylocerenin、2'-(5''-O-E-feruloylapiosyl) betanin、bougainvillein-R-I和3-methoxytyramine-betaxanthin；果肉(RR-F)部位11種(9種BCs和3種BXs)，包括甜菜苷、甜菜苷配基、莧菜紅苷、丙二酰甜菜苷、脫羧丙二酰甜菜苷、apiosyl-betanin、2'-O-apiosylphyllocactin、新丙二酰甜菜苷、脫羧新甜菜苷、梨果仙人掌黃質(zhì)、3-methoxytyramine-betaxanthin和苯丙氨酸—甜菜黃素。RW果實(shí)的果皮(RW-P)部位鑒定了BLs組分 9種(8種BCs和1種BXs)，包括甜菜苷、甜菜苷配基、丙二酰甜菜苷、脫羧丙二酰甜菜苷、apiosyl-betanin、2'-O-apiosylphyllocactin、千日紅苷-III、2-decarboxylated hylocerenin和3-methoxytyramine-betaxanthin；果肉(RW-F)部位未檢測到BLs組分。YW果實(shí)的果皮(YW-P)、果肉(YW-F)部位均未檢測到BCs，僅各檢測到BXs組分1種，均為亮氨酸—甜菜黃素。

圖4 梨果仙人掌黃質(zhì)裂解途徑

圖5 甜菜苷類色素在不同類型果實(shí)與部位的分布

綜上，紅皮紅肉型和紅皮白肉型火龍果中BLs種類豐富，黃皮白肉型則較少；其次，BLs主要分布在紅色果肉和紅色果皮部位，在白色果肉和黃色果皮部位分布較少。RR與RW為紅皮型火龍果，二者含有共有BLs組分，例如甜菜苷、甜菜苷配基、丙二酰甜菜苷和脫羧丙二酰甜菜苷等，但是3種類型火龍果之間未發(fā)現(xiàn)共有BLs組分。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，紅皮紅肉型、紅皮白肉型和黃皮白肉型3種類型火龍果果實(shí)中共鑒定了甜菜苷類色素組分19種，其中甜菜紅色素組分15種，甜菜黃色素組分4種。紅皮紅肉型和紅皮白肉型火龍果中含有共有組分，包括甜菜苷、甜菜苷配基、丙二酰甜菜苷和脫羧丙二酰甜菜苷等。甜菜苷類色素在不同類型果實(shí)及部位的分布存在差異，不同類型果實(shí)甜菜苷類色素種類豐富程度由高至低依次為紅皮紅肉型>紅皮白肉型>黃皮白肉型，不同部位則為：紅皮紅肉型果皮>紅皮紅肉型果肉>紅皮白肉型果皮>紅皮白肉型果肉、黃皮白肉型果皮>黃皮白肉型果肉。研究表明，甜菜苷類色素具有廣泛的生物活性，而且色澤鮮艷，既是理想的功能性食品成分，又是良好的天然植物源著色劑，在食品、藥品、化妝品和寵物食品等行業(yè)應(yīng)用前景廣泛，尤其適于添加到素食人群食品中，將來可對甜菜苷類色素的制備與應(yīng)用進(jìn)行深入研究，實(shí)現(xiàn)火龍果尤其是果皮部位的高值化利用。