液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測肉類中11種鼠藥殘留

鐘菲菲

徐文泱2

楊 韻1

謝芳云1

宋 陽2

黃 燕2

(1. 長沙市食品藥品檢驗(yàn)所國家酒類產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，湖南 長沙 410000；2. 湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院食品安全監(jiān)測與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410017)

鼠藥是減輕鼠害、保證糧食產(chǎn)量的有效手段之一[1]。隨著科技的發(fā)展，殺鼠藥逐漸由劇毒向低毒性轉(zhuǎn)變[2]，抗凝血型殺鼠劑則是近年來被廣泛使用的殺鼠藥類型[3]。這些化合物衍生自無水香豆素核(如殺鼠靈、殺鼠醚、溴敵鼠)和茚滿二酮核(如敵鼠、殺鼠酮、異殺鼠酮)[4]。當(dāng)抗凝血滅鼠藥進(jìn)入人體時(shí)，維生素K環(huán)氧化物還原酶負(fù)責(zé)在合成凝血因子II、VII、IX、X中作為輔因子被消耗后從維生素K環(huán)氧化物中還原被還原的維生素K。此外，抗凝血滅鼠劑可直接破壞毛細(xì)血管壁，引起廣泛的內(nèi)臟出血，導(dǎo)致內(nèi)出血甚至死亡[5-6]。

抗凝血類鼠藥種類眾多，而目前尚未制定有關(guān)食品中鼠藥測定的標(biāo)準(zhǔn)方法，且其檢測存在盲區(qū)和死角。因家禽可能誤食含有鼠藥的餌料使鼠藥進(jìn)入食物鏈而導(dǎo)致中毒事件，因此有必要建立針對此類物質(zhì)的高精度、高通量、多殘留檢測技術(shù)。

目前，鼠藥殘留的檢測方法主要有化學(xué)顯色法[7]、分光光度法[8-9]、薄層色譜法[10]、高效液相色譜法[11-14]和氣/液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法[15-19]。其中前3種方法的檢測準(zhǔn)確度低，假陽(陰)率高，而高效液相色譜法的適用性強(qiáng)，但遇到干擾較大需進(jìn)行定性鑒別時(shí)，液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜則更具優(yōu)勢。鼠藥檢測的報(bào)道多以體液為研究基質(zhì)[20-22]，涉及食品中鼠藥的檢測較少，且食品基質(zhì)多為植物源性食品[23-24]。朱峰等[25]發(fā)現(xiàn)采用QuEChERS方法可得到良好的凈化效果，并通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了辣椒醬、面粉、醋和醬油中的殺鼠醚、殺鼠靈、敵鼠、氯敵鼠、溴敵隆、大隆、殺它仗、鼠得克、克滅鼠、氯殺鼠靈的檢測方法，平均回收率為72.6%～112.0%。

試驗(yàn)擬選取氯殺鼠靈、鼠得克、鼠敵、雙香豆素、溴敵隆、氯鼠酮、溴鼠靈、殺鼠酮、殺鼠醚、華法林和氟鼠酮11種常見抗凝血性鼠藥(見表1)，以肉類為研究基質(zhì)，選擇合適的萃取凈化方式建立液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，以利于食品安全監(jiān)管工作的全面展開，為食品應(yīng)急突發(fā)事件的妥善處理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮豬尾：市售；

水：GB/T 6682規(guī)定的一級水；

乙腈：色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

氯殺鼠靈、鼠得克、鼠敵、雙香豆素、溴敵隆、氯鼠酮、溴鼠靈、殺鼠酮、殺鼠醚、華法林、氟鼠酮：100 mg/L，美國A Chemtek公司；

表1 11種鼠藥的基本信息表

QuEChERs萃取鹽包(6 g MgSO4，1.5 g NaOAc)：日本島津公司；

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜—質(zhì)譜儀： TSQ Quantum ultra型，美國賽默飛世爾科技公司；

分析天平：ME204E型，瑞士梅特勒儀器有限公司；

多管旋渦混合器：945066數(shù)顯型，美國Talboys公司；

多通道平行濃縮儀：MV5型，北京萊伯泰科儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別準(zhǔn)確移取1 mL鼠藥殘留標(biāo)準(zhǔn)溶液于容量瓶中，定容至10 mL。標(biāo)準(zhǔn)系列溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，溶劑為甲醇。

1.3.2 樣品前處理

(1) 提取劑：分別選擇丙酮、乙酸乙酯、乙腈、丙酮+二氯甲烷(V丙酮∶V二氯甲烷=3∶7)進(jìn)行優(yōu)化，選擇最佳提取劑。

(2) 凈化劑：萃取鹽包(6 g MgSO4，1.5 g NaOAc)。

(3) 凈化方法：選擇QuEChERs萃取鹽包、QuEChERs凈化鹽包、中性氧化鋁SPE小柱、硅藻土SPE小柱4種凈化方式，測定平均回收率，并以直接提取不凈化的樣品作參照。同時(shí)，選取不同品牌不同規(guī)格的以PSA為核心成分的QuEChERs凈化鹽包如SINQuEChERS(2 g Na2SO4+0.6 g MgSO4+90 mg PSA+15 MWCNTs)、Wonderpak QuEChERS SPE(900 mg MgSO4+150 mg PSA)和Cleanert MAS-Q(50 mg PSA+50 mg PC+50 mg C18+150 mg MgSO4)進(jìn)行凈化。

(4) 最終優(yōu)化方法：精確稱取2.000 0 g樣品，加入乙腈20 mL，無水硫酸鈉1 g，渦混振蕩30 min，離心取上清液，重復(fù)振蕩，合并上清液，50 ℃氮吹濃縮至10 mL，加入QuEChERs萃取鹽包振蕩1 min，以2 mL甲醇復(fù)溶，有機(jī)濾膜過濾，上機(jī)檢測，計(jì)算平均回收率。

1.3.3 儀器條件

(1) 液相色譜條件：色譜柱為Hypersil Gold C18(100 mm×2.1 mm，3.0 μm)；流速0.2 mL/min；流動(dòng)相A為0.05 mol/L乙酸銨水溶液，流動(dòng)相B為甲醇，梯度洗脫條件見表2。

表2 梯度洗脫程序

(2) 質(zhì)譜條件：電噴霧電離；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；噴霧電壓2 500 V；傳輸毛細(xì)管溫度500 ℃；駐留時(shí)間34.712 s，質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置見表3。

表3 多反應(yīng)監(jiān)測模式下11種鼠藥的質(zhì)譜參數(shù)

1.3.4 基質(zhì)效應(yīng)評價(jià) 選取雞肉、牛肉以及豬尾配制空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別以空白基質(zhì)和甲醇配制系列標(biāo)準(zhǔn)曲線，以空白基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積和試劑中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積的比值考察基質(zhì)效應(yīng)。

1.3.5 線性范圍和檢出限 配制11種鼠藥殘留質(zhì)量濃度分別為0.2，0.4，0.8，2.0，4.0，8.0，16.0，32.0，100.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以所述儀器條件進(jìn)樣。

1.3.6 回收率和精密度 選取3種畜禽肉類進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)。加標(biāo)量為0.1，0.2，1.0 μg/kg，樣品均質(zhì)后，加入不同體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并靜置24 h，按前處理方法提取凈化后上機(jī)測試。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 23軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以3次平行試驗(yàn)的平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑優(yōu)化

試驗(yàn)表明，當(dāng)以乙腈為提取劑時(shí)，樣品回收率最高。這可能是由于丙酮和二氯甲烷易萃取出大量脂類，用其對豬尾中殘留的鼠藥進(jìn)行提取時(shí)，離心管中會出現(xiàn)明顯的呈凝膠固態(tài)的高蛋白，無法進(jìn)行進(jìn)一步的凈化。而乙酸乙酯對于中等脂類的食品基質(zhì)如牛奶、甲殼類和肉類的萃取更具選擇性，但對于高脂肪食品則需要可溶解、滲透脂肪的非極性溶劑來萃取聚集在基質(zhì)中的高親脂性鼠藥，此時(shí)可能要選用凝膠色譜進(jìn)行凈化，而這種儀器價(jià)格昂貴，較難滿足基層實(shí)驗(yàn)室對安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)管的要求。乙腈不溶于水，且鹽類的加入有利于更多的鼠藥進(jìn)入有機(jī)溶劑層。因此選擇乙腈為最終的提取劑，且提取次數(shù)固定為2次。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用含有PSA的QuEChERs凈化后，鼠藥回收率最低，可能是由于PSA填料對鼠藥有極好的吸附作用，上清液中的鼠藥均附著在PSA上而溶液中幾乎無殘留。采用中性氧化鋁及硅藻土SPE小柱凈化后，鼠藥回收率基本<50%，而未凈化的回收率普遍>110%，說明未凈化可能會帶來干擾，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此選擇萃取鹽包為凈化試劑。

2.3 儀器條件優(yōu)化

由圖1可知，采用1.3.3的液相色譜條件可在10 min內(nèi)分離所有分析物，分離度佳且峰形良好，說明4.0 μg/L甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的分離效果及響應(yīng)值最高。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

由表4可知，11種鼠藥的基質(zhì)效應(yīng)為0.92～1.09，說明基質(zhì)對測定結(jié)果的影響較小，因此在配制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)用甲醇試劑即可。

圖1 11種鼠藥的MRM色譜圖

2.5 線性范圍和檢出限

由表5可知，11種鼠藥殘留在0.2～100.0 μg/L范圍內(nèi)線性方程相關(guān)性良好，根據(jù)GB/T 27404—2018《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》獲得定量限為0.1 μg/kg。

2.6 回收率和精密度

由表6可知，鼠得克、雙香豆素、溴敵隆、殺鼠醚、氯鼠酮、華法林、殺鼠酮、氯殺鼠靈、鼠敵、溴鼠靈和氟鼠酮11種鼠藥的回收率為60.2%～119.3%，符合GB/T 27404—2008的技術(shù)參數(shù)要求。而且所有鼠藥檢測結(jié)果的精密度均<20%。

表4 11種鼠藥在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)

表5 11種鼠藥殘留的線性方程和相關(guān)系數(shù)

表6 肉中11種鼠藥殘留的回收率和精密度

續(xù)表6

3 結(jié)論

建立了同時(shí)測定動(dòng)物源性食品中氯殺鼠靈、鼠得克、鼠敵、雙香豆素、溴敵隆、氯鼠酮、溴鼠靈、殺鼠酮、殺鼠醚、華法林和氟鼠酮11種鼠藥的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。結(jié)果表明，試驗(yàn)方法在0.2～100.0 μg/L范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)線性方程相關(guān)系數(shù)可達(dá)到0.99，當(dāng)加標(biāo)量為0.1，0.2，1.0 μg/kg 時(shí)的回收率為60.2%～119.3%，該殘留方法的開發(fā)有利于填補(bǔ)監(jiān)測死角，為處理食品應(yīng)急突發(fā)事件提供技術(shù)支持。后續(xù)可進(jìn)一步擴(kuò)大食品基質(zhì)種類，建立高通量的檢測方法，完善方法的適用性、科學(xué)性和可行性。