鱸魚脯氨酰內肽酶的分離純化、性質分析及分子克隆

楊汝晴，陳守峰，肖琳琳，陳玉磊,2，孫樂常,2，張凌晶,2，劉光明,2，曹敏杰,2,

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.海洋食品深加工協同創新中心，遼寧 大連 116034）

脯氨酰內肽酶（prolyl endopeptidase，PEP）又稱脯氨酸寡肽酶，是絲氨酸蛋白酶家族中的一員[1]。該酶不同于經典的胰蛋白酶-枯草桿菌絲氨酸蛋白酶，PEP家族的分子質量（約80 kDa）普遍大于胰蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶（25～30 kDa）。基于其對肽底物的特異性和不同的活性中心結構，PEP代表了一類相對較新的絲氨酸蛋白酶[2]。PEP易在含有脯氨酸殘基的羧基處切割肽鍵，它也會在丙氨酸殘基處分解，但水解速度較慢。PEP最顯著的特性是對分解底物的選擇性，僅限于長度不超過30 個氨基酸殘基的寡肽[3]。

PEP最初是在人子宮中被發現，用于水解催產素半胱氨酰-酪氨酰-異亮氨酰-谷氨酰胺酰-天冬酰胺酰-半胱氨酰-脯氨酰-亮氨酰-甘氨酸（Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2）脯氨酸殘基的C末端釋放亮氨酰甘氨酸[4]。進一步工作發現PEP在水解生物活性肽如促甲狀腺素釋放激素、物質P、精氨酸加壓素、神經緊張素、血管緊張素等方面也有作用[5]。此外，PEP是阿爾茨海默癥、健忘癥、抑郁癥等疾病治療的靶標酶[6]，針對PEP的特異性抑制劑有望成為候選藥物[7-8]。在啤酒釀造過程中添加PEP，可水解來源于富含脯氨酸殘基的α-醇溶蛋白多肽，達到防止啤酒渾濁、穩定其質量的效果[9-10]。該酶還用于重組功能肽的制備和口服治療由于攝入麩質引起的過敏反應[11-12]。由于PEP獨特的底物特異性，其可能與基質金屬蛋白酶等一起參與富含脯氨酸殘基的動物肌肉膠原的新陳代謝以及死后的軟化自溶[13-14]。

在水產動物PEP研究方面，鯉魚、羅非魚等淡水魚類骨骼肌中的PEP已被純化和表征[13,15]，海水魚藍圓鰺PEP也得到了初步研究[16]。鱸魚（Lateolabrax japonicus）由于其營養價值和獨特的風味已成為我國沿海地區一種重要的海水養殖魚類。但海水魚類PEP的詳細性質、基因序列、結構特征等還鮮有報道。因此，本研究擬以海水鱸魚為研究對象，從其肌肉中純化PEP并對其酶學性質進行分析，克隆PEP全長序列并通過同源建模解析鱸魚PEP的結構，旨在為深入研究海水魚類PEP的酶學性質提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活鱸魚平均體質量約1 kg，購于廈門市集美菜市場。

DEAE-Sepharose、Phenyl-Sepharose HiTrap、DEAESepharose Fast Flow 美國GE Healthcare公司；琥珀酰-甘氨酰-脯氨酸-4-甲基-7-香豆素（succinyl-glycyl-L-proline-4-methylcoumaryl-7-amide，Suc-Gly-Pro-MCA）等熒光底物 日本Peptide Institute公司；PEP特異性抑制劑SUAM-14746、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF） 美國Sigma公司；半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64 美國Amresco公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris） 青島福林生物化學公司；牛血清蛋白、十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺 美國Bio-Rad公司；Oligo dT、dNTP Mixture、DL2000 DNA Marker、2×SYBR?Premix ExTaqTMII 日本TaKaRa公司；pMD?18-T載體、T1感受態細胞 北京全式金生物技術有限公司；其他試劑如無特殊說明均為分析純。

1.2 儀器與設備

PT-2100組織搗碎機 瑞士Kinematica公司；Avanti J-26SXP高速冷凍離心機 美國Beckman公司；Lamda 35紫外分光光度計 美國Perkin Elmer公司；FP-8200熒光分光光度計 日本Jasco公司；G:BOX凝膠成像儀英國Synegene公司；Chirascan圓二色譜儀 英國Applied Photophysics公司；C1000-Touch聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 鱸魚PEP的純化

所有純化步驟均在4 ℃進行。鱸魚即殺后取肌肉800 g，切碎，將其在4 倍體積的緩沖液A（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，含4 mmol/L 2-巰基乙醇）中組織搗碎，15 000×g離心30 min，所得上清液即為PEP粗酶。

粗酶經60%～80%飽和度的(NH4)2SO4溶液鹽析，所得沉淀溶解于少量的緩沖液A中，并用緩沖液A充分透析。透析樣品上樣于DEAE-Sepharose陰離子交換柱（2.5 cm×15 cm），經緩沖液A充分流洗后，以0～0.3 mol/L的NaCl溶液線性梯度洗脫。收集酶活力較高部分，加入(NH4)2SO4至終濃度為1.2 mol/L，上樣于Phenyl-Sepharose，以1.2～0 mol/L (NH4)2SO4溶液線性梯度洗脫，收集活性部分，用緩沖液A透析后上樣于HiTrap DEAE-Sepharose Fast Flow（5 mL）并以0～0.3 mol/L NaCl溶液線性梯度洗脫。將活性部分收集即為純化的PEP，立即用于酶學性質分析。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對酶的純度進行分析。以牛血清白蛋白為標準，采用Bradford法測定蛋白質濃度。

1.3.2 PEP活力測定

參考謝雪瓊等[17]的方法并作少量修改。將50 μL酶溶液溶于900 μL的25 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 6.0）中，加入50 μL、10 μmol/L的底物Suc-Gly-Pro-MCA，在35 ℃孵育30 min后，加入1.5 mL終止液（甲醇-異丙醇-蒸餾水（35∶30∶35，V/V））終止反應。用熒光分光光度計在380 nm激發波長和450 nm發射波長下測定產物7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）的熒光強度。酶活力單位定義為每分鐘釋放1 nmol AMC的量。

1.3.3 肽序列的液相色譜-串聯質譜分析

采用考馬斯藍染料對SDS-PAGE進行染色，脫色后切膠獲取目的蛋白條帶，送往深圳市微納菲生物技術有限公司進行液相色譜-串聯質譜鑒定。

1.3.4 溫度和pH值對PEP活力的影響

通過在不同溫度（15、25、35、45、55、65 ℃）條件下進行酶促反應確定PEP的最適溫度。研究PEP的熱穩定性，將PEP置于不同溫度條件下孵育30 min，然后立即在冰水中冷卻，在35 ℃條件下測定殘余活力。

確定PEP的最適pH值，在35 ℃條件下用不同pH值（pH 3.0～9.0）的緩沖液進行酶活力測定。對PEP進行pH值穩定性研究，將PEP置于各pH值緩沖液中，4 ℃孵育6 h，取50 μL酶溶液和900 μL 25 mmol/L PBS（pH 6.0）混合，35 ℃反應30 min。測定其剩余酶活力。

1.3.5 抑制劑對PEP活力的影響

分析蛋白酶抑制劑對PEP活力的影響，將PEP與蛋白酶抑制劑在室溫下孵育30 min，然后按1.3.2節方法測定剩余酶活力。以不添加抑制劑的反應體系為對照。

1.3.6 圓二色譜分析

采用圓二色譜法分析熱變性和冷卻復性過程中PEP二級結構的變化。操作參數如下：樣品（0.2 mg/mL）從25 ℃加熱到95 ℃，然后從95 ℃冷卻到25 ℃，速率為2 ℃/min，波長為190～260 nm。為了研究鱸魚PEP的變性溫度Tm值，數據通過Prism（version 7.0）進行擬合分析。

1.3.7 PEP分子克隆及多序列比對

根據GenBank中已經報道的多個物種PEP的基因序列，利用Primer5.0軟件設計引物。首先進行鱸魚PEP開放閱讀框部分基因克隆。在獲得片段序列的基礎上，設計3’RACE/5’RACE的特異性引物（表1）。

表1 PEP基因克隆相關引物Table 1 Primers used for the cloning of PEP

采用Eastep?總RNA提取試劑盒從鱸魚肌肉組織中提取總RNA，用PrimeScript II Strand cDNA合成試劑盒合成第1鏈cDNA。通過快速擴增cDNA末端（RACE）獲得3’/5’RACE-ready cDNA。以3’/5’RACE-ready cDNA為模板，通過嵌套式PCR擴增并將所有PCR產物均經凝膠純化，連接到pMD?18-T載體上，轉化到T1感受態細胞中。對陽性克隆的片段進行測序，并組裝成PEP的全長cDNA（NCBI：KX688546.1）。在NCBI數據庫中利用BLAST搜尋來源于人以及紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）的PEP序列；利用MEGA 5軟件、Espript 3.0和Clustal網站對3 種酶的基因序列進行同源性比對。

1.4 數據及圖像處理

采用SPSS 18.0軟件進行數據分析，所有實驗數據均重復3 次進行測定。應用Origin 8.0軟件進行繪圖。凝膠成像圖片采用Adobe Illustrator CS5進行標注。采用Prism（version 7.0）軟件擬合PEP的變性溫度。

2 結果與分析

2.1 PEP的分離純化及質譜鑒定

如圖1所示，(NH4)2SO4鹽析后的PEP粗酶液通過DEAE-Sepharose陰離子交換柱，大部分的雜蛋白在流洗部分被去除，當NaCl濃度為0.25 mol/L時，PEP被洗脫下來，再上樣于Phenyl-Sepharose HiTrap疏水層析柱，在未吸附部分去除大部分雜蛋白。收集活性部位，經HiTrap DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析后酶活峰與蛋白峰重疊。通過SDS-PAGE分析（圖1D），該酶顯示出對應于80 kDa的單一條帶，說明PEP得到高度純化。該蛋白的分子質量與已報道來源于鯉魚、羅非魚骨骼肌的PEP分子質量相似[13,15]。從800 g鱸魚骨骼肌中純化得到0.7 mg的PEP，得率為0.3%，純化倍數為238.1 倍（表2）。

圖1 PEP的柱層析純化及SDS-PAGEFig.1 Column chromatography purification of PEP and SDS-PAGE pattern of purified PEP

表2 鱸魚PEP的純化結果Table 2 Summary of purification procedure of prolyl endopeptidase from sea bass

將純化的PEP電泳后切膠，經胰蛋白酶酶解后進行液相色譜-串聯質譜分析，共得到43 個肽段。通過NCBI上的BLAST分析，結果如圖2所示，所得到的43 個肽片段與紅鰭東方鲀的PEP（XP_003971930.1）序列高度一致，表明純化的蛋白為PEP。

圖2 純化PEP的液相色譜-串聯質譜分析Fig.2 LC-MS/MS analysis of purified PEP

2.2 PEP的酶學性質分析

2.2.1 底物特異性

選用不同類型的熒光底物對PEP的底物特異性進行研究，結果如表3所示。鱸魚PEP對PEP底物Suc-Gly-Pro-MCA和琥珀酰-甘氨酰-脯氨酰-亮氨酰-甘氨酰-脯氨酸-4-甲基香豆素-7-酰胺（succinyl-glycyl-L-prolyl-L-leucylglycyl-L-proline-4-methylcoumaryl-7-amide，Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-MCA）水解能力強，而對胰蛋白酶底物叔丁基氧羰基-谷氨酰胺酰-精氨酰-精氨酸-4-甲基-7-香豆素（t-butyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-arginyl-L-arginine-4-methylcoumaryl-7-amide，Boc-Gln-Arg-Arg-MCA）、叔丁基氧羰基-苯丙氨酰-絲氨酰-精氨酸-4-甲基-7-香豆素（t-butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-seryl-L-arginine-4-methylcoumaryl-7-amide，Boc-Phe-Ser-Arg-MCA），胰凝乳蛋白酶底物琥珀酰-亮氨酰-亮氨酰-纈氨酰-酪氨酸-4-甲基-7-香豆素（succinyl-L-leucyl-L-leucyl-L-valyl-L-tyrosine-4-methylcoumaryl-7-amide，Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA），組織蛋白酶底物芐氧羰基-苯丙氨酰-精氨-4-甲基-7-香豆素（benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-arginine 4-methylcoumaryl-7-amid，Z-Phe-Arg-MCA）、芐氧羰基-精氨酰-精氨酸-4-甲基-7-香豆素（benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-arginine-4-methylcoumaryl-7-amide，Z-Arg-Arg-MCA），氨肽酶底物脯氨酸-4-甲基-7-香豆素（L-prolin-4-methylcoumaryl-7-amide，Pro-MCA）和甲硫氨酸-4-甲基-7-香豆素（L-methionine-4-methylcoumaryl-7-amide，Met-MCA）均不分解。PEP不能水解含脯氨酸的氨肽酶底物Pro-MCA，證實了PEP是一種內肽酶[18]。

表3 PEP的底物特異性Table 3 Substrate specificity of PEP

2.2.2 抑制劑對PEP的影響

如表4所示，PEP的特異性抑制劑SUAM-14746能夠完全抑制PEP活力，絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF對PEP也具有強烈的抑制作用。金屬蛋白酶抑制劑EDTA、半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64則幾乎沒有抑制作用。這些結果反映了PEP是一類特殊的絲氨酸蛋白酶。

表4 抑制劑對PEP活力的影響Table 4 Effects of inhibitors on PEP activity

2.2.3 最適溫度和熱穩定性分析

在pH 6.0的25 mmol/L PBS中，以Suc-Gly-Pro-MCA為底物，測定不同溫度下酶的相對活力。如圖3A所示，鱸魚PEP的最適溫度為35 ℃，在15～35 ℃范圍內，隨著溫度的逐漸升高，鱸魚PEP活力也逐漸增加；當溫度高于40 ℃時，活力迅速降低。在15～35 ℃范圍內PEP活力較穩定，當溫度高于35 ℃時PEP活力開始降低，45 ℃以上時PEP活力急劇下降，45 ℃活性僅保持20%，65 ℃時，活性不足10%，說明該酶的熱穩定性較差。

圖3 溫度（A）和pH值（B）對PEP活力的影響Fig.3 Effect of temperature and pH on the activity of PEP

2.2.4 最適pH值和pH值穩定性

如圖3B所示，在pH 4.0～6.0范圍時，隨著pH值的逐漸升高，鱸魚PEP的活性逐漸增加；在pH 6.0～9.0范圍時，隨著pH值的逐漸升高，酶活力逐漸減少直至完全失活。因此，鱸魚PEP的最適pH值為6.0。鱸魚PEP在pH 5.0～8.0范圍內穩定性較好，活力可保持在80%以上。而當pH值低于5或者高于8.0時，酶活力快速下降，與已經報道的羅非魚肌肉中純化的PEP結果相似[15]。

2.3 溫度對PEP結構的影響

為了研究溫度對PEP結構變化的影響，用圓二色譜分析PEP的熱變性曲線。天然PEP在25 ℃呈典型的β-折疊結構（圖4A），在215 nm波長處出現負最大峰，在圓二色譜192 nm波長處為正的最小峰。PEP主要是由α-螺旋的催化結構域，以及β-折疊形成β-螺旋槳的非催化區域組成[19]。當PEP被加熱到95 ℃時，192 nm波長處的峰值降低，結構發生改變。當溫度從95 ℃又下降到25 ℃時，PEP的二級結構不能恢復，說明PEP的熱變性是不可逆的。在200 nm波長處用圓二色譜監測PEP的構象變化（圖4B），結果表明，PEP的結構在20～40 ℃范圍內變化最小，表明在該溫度范圍內PEP結構較為穩定。溫度高于40 ℃時，PEP結構變化較為明顯，而高于60 ℃后，PEP結構保持不變，說明PEP變性已完成。通過Prism（version 7.0）擬合分析，發現鱸魚PEP的變性溫度Tm為（51.2±0.3）℃。

圖4 圓二色譜檢測溫度對PEP結構的影響Fig.4 Effect of temperature on the structure of PEP detected by CD spectroscopy

2.4 PEP的分子克隆

為了更多了解PEP的結構特性，通過比對已報道的不同物種PEP的序列設計引物，得到鱸魚PEP的編碼區中間部分基因。根據得到的基因片段分別設計3’末端和5’末端引物（圖5A），再經過一系列PCR擴增，對所得到的基因進行拼接，最終獲得鱸魚PEP cDNA的全長為3 029 bp，包含一個長度為2 223 bp，編碼741 個氨基酸殘基的開放閱讀框。5’端非翻譯區（untranslated regions，UTR）長度為30 bp，3’端UTR長度為776 bp，通過ProtParam網站（https://web.expasy.org/protparam/）計算其理論分子質量為84.12 kDa，在GenBank登錄號為KX688546.1。運用Swiss-Model以人源脯氨酰內肽酶PEP（PDB∶3DDU）為模板，進行同源建模分析其結構。如圖5B所示，鱸魚PEP包含α/β水解肽酶結構，其催化三聯體（His-711、Asp-672、Ser-585）被β-折疊形成的螺旋槳區域的中心通道所覆蓋。該β-折疊螺旋槳結構域具有一個門控過濾器的作用，將分子質量大、結構化的肽從活性位點排除[2]。

圖5 PEP的分子克隆及同源建模Fig.5 Molecular cloning and homology modeling of PEP

利用MEGA 5軟件、Espript 3.0和Clustal網站對鱸魚PEP、紅鰭東方鲀PEP（GenBank：XP_003971930.1）、人源（Homo sapiens）PEP（GenBank：BAB19053.1）以及皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai）PEP（GenBank：ARR29117.1）的蛋白序列進行同源性比對。多序列比對結果表明，鱸魚PEP氨基酸序列與紅鰭東方鲀PEP的同源性高達92.1%，與人及皺紋盤鮑PEP的同源性為72.1%和58.3%（圖6），但與黃桿菌來源的PEP的序列相似性僅有38.3%。以上結果表明，相似物種中PEP高度保守，但不同物種間的序列差異性較大。

圖6 PEP與其他物種的多序列比對Fig.6 Multiple sequence alignment of PEP with that from other species

3 討 論

為了研究海水魚肌肉中PEP的性質，解明其結構特性，本研究從鱸魚肌肉中高度純化PEP。不同物種PEP的分子質量大小存在較大差異，60～87 kDa不等[20-24]。從鱸魚肌肉中純化的PEP分子質量約為80 kDa，與鯉魚肌肉（82 kDa）[13]和人腦（80 kDa）[25]中PEP的分子質量相似。對底物特異性研究發現，大多數的蛋白酶都無法在脯氨酸殘基上水解，而PEP幾乎能分解所有長度小于30 個氨基酸殘基并內含脯氨酸殘基的肽[26]。

構象對蛋白酶的活性有重要影響，而構象的改變大多與溫度有關[27]。PEP的最適溫度為35 ℃，但是其熱穩定性較差，在較低的溫度范圍（4～37 ℃）內能保持較高的活性[22,28]，當溫度高于45 ℃時，酶活力急劇下降。采用圓二色譜法測定了熱變性前后PEP二級結構的變化。結果表明，加熱對PEP的二級結構有明顯改變，且該熱變性過程不可逆。PEP熱穩定較差可能與其活性部位的構象易受溫度影響相關。當加熱溫度達到40 ℃時，PEP二級結構即開始發生變化（圖4B），酶活力也明顯下降。作為絲氨酸蛋白酶，PEP的活性中心由His、Asp和Ser組成催化三聯體構象。溫度升高后三聯體的結構發生改變導致酶失活[27]。PEP活力形式和非活性形式的主要區別在于酶活力中心，一般地，活性中心比蛋白整體對熱更敏感，活性損失總是先于蛋白變性[29]。因此，當溫度升高酶失去活性時，并不表示蛋白整體構象已發生改變。

迄今為止，PEP基因已從許多生物體中被克隆得到[30-31]。然而，對魚類PEP基因序列和結構的研究卻很少。作為魚類PEP基因表達調控機制的初步研究，克隆了編碼741 個氨基酸殘基的鱸魚PEP基因，該基因比來源于哺乳動物和微生物的PEP基因稍長[28,32]。根據推導的氨基酸序列和已知的人源模板蛋白的結構，預測了鱸魚PEP的三維結構。其結構與已經報道的人、豬以及微生物PEP的結構基本相似[19,28,33]，都以典型的α/β水解酶折疊排列，包括催化結構域和β-螺旋槳兩個結構組成，β-螺旋槳結構域呈放射狀布置在埋入圓柱內的中央通道周圍[18]。相比于動物源PEP，微生物PEP能降解長度更長的底物，這是由于微生物PEP的催化結構域和β-螺旋槳結構域中存在一個構象柔軟的開放形態[34]，而動物源PEP的兩個結構域之間是閉環狀態[35]。PEP基于這樣的獨特結構實現對進入催化結構域的底物長度進行有效控制[19]。作為能夠特異性切割脯氨酸殘基的內源性蛋白酶，在前期的工作中PEP已被證實參與膠原小肽的降解，因此推測其與魚類死后自溶過程中肌肉彈性下降關系密切的膠原蛋白降解相關[13-14]。但是，PEP在魚體內，特別是生理條件下肌肉內的主要功能并不清晰。為了進一步解明魚類PEP在肌肉內的功能與作用，下階段有必要從組織分布以及結構信息學角度深入分析。

4 結 論

從鱸魚骨骼肌中純化得到PEP，確定其分子質量約為80 kDa，最適pH值為6.0，最適溫度為35 ℃。溫度變化對酶活力和二級結構影響較大，且酶活力變化的溫度低于蛋白整體的變性溫度。通過分子克隆技術獲得PEP全長序列含2 226 個核苷酸，編碼741 個氨基酸殘基。通過同源建模得到鱸魚PEP的分子結構，其中His-711、Asp-672、Ser-585構成空間構象的活性中心。PEP活性部分更容易受到溫度影響而使三聯體的結構改變導致酶失活，而PEP的底物特異性也與其結構特征密切相關。由于PEP水解脯氨酸殘基的底物特異性，PEP很可能與魚體肌肉中富含脯氨酸殘基的膠原蛋白的新陳代謝密切相關。