鏈格孢侵染采后甜瓜病程相關(guān)蛋白基因表達(dá)及酶活性變化規(guī)律

王 瑾，白羽嘉,2,，馮作山，朱婉彤，曾禹?？?，蔣莉瑩

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆果品采后科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)作物學(xué)博士后科研流動站，新疆 烏魯木齊 830052）

厚皮甜瓜（Cucumis meloL.）是一年生蔓性草本植物，是西北地區(qū)效益較好的一種經(jīng)濟(jì)作物[1]。伽師瓜是新疆特有的晚熟型厚皮甜瓜品種，耐貯藏[2]。86-1甜瓜為中晚熟厚皮甜瓜，貯藏性一般。兩種甜瓜肉質(zhì)松脆，甘甜爽口，果肉顏色相近，呈橘紅色。果皮存在較大差異，伽師瓜果皮呈墨綠色，表面致密，無網(wǎng)紋或兩端覆少網(wǎng)紋；86-1甜瓜果皮呈黃色夾雜綠色，通體布有網(wǎng)紋。

真菌病原菌是引起我國甜瓜腐爛的主要原因[3-4]。其中鏈格孢是采后甜瓜貯藏期間的優(yōu)勢致病菌，引起甜瓜黑斑病[5]，甜瓜感染鏈格孢后，果實初期呈水漬狀濕腐，果面變軟腐爛，后在爛果表面產(chǎn)生大量黑霉，即病菌分生孢子梗和分生孢子，最終導(dǎo)致采后甜瓜腐爛變質(zhì)[6-7]。真菌細(xì)胞壁以幾丁質(zhì)、纖維素為骨架，以β-1,3葡聚糖及蛋白質(zhì)為主要填充物，保持真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)完整性[8-9]。病原菌侵染后，植物細(xì)胞分泌幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHT）和β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）消化真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)和β-1,3-葡聚糖，破壞并裂解真菌細(xì)胞壁骨架，影響其形態(tài)建成、生長發(fā)育和致病力等[10]。目前，研究人員對甜瓜病程相關(guān)蛋白基因的研究僅針對于甜瓜果肉，如研究采后鏈格孢侵染甜瓜果肉CHT和GLU基因的變化規(guī)律[11-12]；對果皮的研究多集中在CHT、GLU活性，如研究采后損傷接種鏈格孢菌，甜瓜果皮和果肉CHT、GLU活性變化規(guī)律[13-14]，對甜瓜果皮和果肉CHT、GLU基因和酶活綜合性研究鮮見報道。而果皮是甜瓜抵御病原菌侵染的第一道防線，也是最重要的物理抗病結(jié)構(gòu)[15]，具有重要的研究價值。

本研究以伽師瓜和86-1甜瓜為材料，損傷接種鏈格孢，測定病斑直徑，觀察病斑組織顯微結(jié)構(gòu)，實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，realtime PCR）比較CmGLU、CmCHT1、CmCHT2相對表達(dá)量，測定CHT和GLU活性。研究鏈格孢侵染采后伽師瓜和86-1甜瓜果皮和果肉組織的抗病性差異，旨在為甜瓜采后貯藏保鮮提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

伽師瓜、86-1甜瓜采摘自新疆喀什地區(qū)伽師縣，伽師瓜單果質(zhì)量（4.12±0.55）kg，邊緣可溶性固形物＞12 °Brix，86-1甜瓜單果質(zhì)量（3.5±0.5）kg，邊緣可溶性固形物＞12 °Brix。

鏈格孢菌：從自然發(fā)病的伽師瓜果實分離，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）保存。

30% H2O2、3,5-二硝基水楊酸、丙酮、冰乙酸、結(jié)晶酚、酒石酸鉀鈉、L-抗壞血酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、無水乙酸鈉、五水合四硼酸鉀 、亞硫酸鈉（均為分析純） 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；二甲苯、中性樹膠（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；幾丁質(zhì)、昆布多糖（均為分析純） 美國西格瑪奧德里奇公司；焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、脫鹽蝸牛酶、β-巰基乙醇、瓊脂糖生工生物工程（上海）股份有限公司；PDA培養(yǎng)基北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；六銨銀染液 武漢谷歌生物科技有限公司；Trans2K DNA Marker、TransZol北京全式金生物技術(shù)有限公司；5×All-In-One Master Mix（with Accu RT Genomic DNA Removal Kit）、EvaGreen 2×qPCR Master Mix-Low ROX 加拿大ABM公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MyCycler Thermal Cycler型PCR儀 美國Bio-Rad公司；QuantStudioTM6 Flex real-time PCR Syste 美國ABI公司；Nefuqe 15R型高速冷凍離心機 上海力申科學(xué)儀器有限公司；TGL-16G型高速冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；DYCZ-21型電泳槽、DYY-6C型電泳儀電源北京市六一儀器廠；2500型凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；K5500型核酸蛋白定量儀 北京凱奧科技發(fā)展有限公司；ME204型電子天平、FE20型pH計上海梅特勒-托利多儀器有限公司；XHF-DY型高速分散器寧波新芝生物科技股份有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用公司；RM2016型病理切片機上海徠卡儀器有限公司；DS-U3成像系統(tǒng) 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 甜瓜預(yù)處理

甜瓜表面用2% H2O2溶液浸泡殺菌，晾干待用[16]。

1.3.2 鏈格孢侵染

沿甜瓜果實赤道等距穿刺打孔（直徑3.5 mm，深度5 mm），每孔接入鏈格孢孢子懸浮液20 μL（1×106spores/mL，含0.01%吐溫-20）[17]，對照組接入等量無菌水，（7±1）℃、相對濕度85%～90%冷庫貯藏。

1.3.3 取樣

處理后第0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30天取樣。隨機選擇6 個甜瓜，測量病斑大小（包括過敏反應(yīng)組織）[18]，取發(fā)病與健康組織交界5 mm處果皮和果肉組織，液氮速凍，－80 ℃保存。

處理后第0、6、9、21、30天各取1 個甜瓜隨機選擇3 處病斑，取發(fā)病與健康組織交界處果皮和果肉組織（10 mm×10 mm），甲醛-乙酸-乙醇（formaldehyde-acetic acid-ethanol fixative，F(xiàn)AA）固定液固定，4 ℃保存。

1.3.4 組織切片顯微結(jié)構(gòu)觀察

采用過碘酸六胺銀（periodic acid-silver metheramine，PASM）染色法。FAA固定液中取出甜瓜組織→修整→脫水→石蠟包埋→切片→脫蠟→高碘酸染色→蒸餾水沖洗→六胺銀染色液孵育染色→硫代硫酸鈉處理→蒸餾水沖洗→復(fù)染伊紅→脫水→中性樹膠封片→全自動數(shù)字玻片掃描系統(tǒng)（Pannoramic DESK）獲取圖像文件→Caseviewer（C.V 2.3）軟件分析。

1.3.5 鏈格孢侵染采后甜瓜病程相關(guān)蛋白基因表達(dá)變化分析

1.3.5.1 real-time PCR引物設(shè)計

CmCHT1-F/R參考甜瓜CHT基因序列（MG823396、MG823397、MELO3C023247T1），CmCHT2-F/R參考甜瓜CHT基因序列（MG823398；MG823399、MELO3C006069T1），CmGLU-F/R參考甜瓜GLU基因序列（MG823400、MG823402、MELO3C022133T1），內(nèi)參基因CmGAPDH-F/R參考甜瓜甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因序列（XM_008441195.2）。引物信息見表1。

表1 熒光定量mRNA檢測引物信息Table 1 Primer sequences used for quantitative fluorescent PCR

1.3.5.2 總RNA的提取

甜瓜組織液氮研磨，總RNA提取試劑盒（TransZol，ET101）提取總RNA。核酸蛋白定量儀檢測RNA濃度，瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。

1.3.5.3 檢測mRNA的cDNA合成

使用5×All-In-One MasterMix（with AccuRT Genomic DNA Removal Kit）反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA?？俁NA 1 mg、Random Primer（0.1 μg/μL）1 μL、2×TS Reaction Mix 10 μL、TransScript?RT/RI Enzyme Mix 1 μL、gDNA Remover 1 μL、RNase-Free Water補足至20 μL?；靹?，25 ℃反應(yīng)10 min，42 ℃反應(yīng)30 min，85 ℃反應(yīng)5 s取出，結(jié)束反轉(zhuǎn)錄實驗。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA置于－80 ℃保存。

1.3.5.4 real-time PCR條件

real-time PCR體系：2×SYBR Green Select Mix 5 μL、Forward Primer 0.7 μL、Reverse Primer 0.7 μL、ROX 0.05 μL、cDNA 1 μL，RNase-Free Water補足至10 μL，輕輕混勻。95 ℃反應(yīng)2 min；95 ℃反應(yīng)15 s，60 ℃反應(yīng)30 s（40 個循環(huán)）。以CmGAPDH為內(nèi)參基因，用2－ΔΔCt法計算甜瓜不同時間內(nèi)CmCHT1、CmCHT2、CmGLU的相對表達(dá)量。

1.3.6 CHT和GLU活性的測定

參照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用最小顯著性差異法多重比較進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05，差異顯著），Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈格孢侵染甜瓜果實病斑發(fā)生規(guī)律

鏈格孢菌侵染采后伽師瓜和86-1甜瓜果實，86-1甜瓜第6天時出現(xiàn)病斑，伽師瓜第9天時出現(xiàn)病斑，病斑直徑隨貯藏時間呈不斷擴(kuò)大的趨勢（圖1），且86-1甜瓜病斑直徑始終大于伽師瓜。第30天時，86-1甜瓜果皮和果肉病斑直徑是伽師瓜的1.28 倍和1.29 倍，差異顯著（P＜0.05）。表明伽師瓜抵抗鏈格孢侵染的能力高于86-1甜瓜。

圖1 鏈格孢侵染甜瓜果實病斑直徑變化趨勢Fig.1 Change in lesion diameter in two melon cultivars after infection by Alternaria alternata

鏈格孢菌侵染甜瓜果實，果皮及果肉組織病斑直徑存在差異，果肉病斑直徑始終大于果皮。侵染第30天時，伽師瓜果肉和果皮病斑直徑分別為2.50 cm和2.21 cm，86-1甜瓜果肉和果皮病斑直徑分別為3.20 cm和2.86 cm，差異顯著（P＜0.05）。表明甜瓜果皮抗病能力高于果肉。

鏈格孢侵染甜瓜果實階段，研究發(fā)現(xiàn)接種深度5 mm，接種量20 μL，侵染9 d出現(xiàn)病斑；侵染15～30 d病斑直徑幾乎呈線性擴(kuò)大。根據(jù)病斑出現(xiàn)時間和大小，確定0～9 d為侵染潛伏期，6～15 d為侵染初期，15～24 d為侵染中期，24～30 d（＞30 d）為侵染末期。

2.2 鏈格孢侵染對伽師瓜和86-1甜瓜果實組織切片觀察

選擇侵染發(fā)生的關(guān)鍵時期（包括未侵染0 d、侵染初期6 d/9 d、侵染中期21 d、侵染末期30 d）的組織樣品，進(jìn)行PASM染色，觀察病斑及周圍組織顯微結(jié)構(gòu)，了解真菌菌絲的侵入情況。

圖3 鏈格孢侵染甜瓜果肉PASM染色（×200）Fig.3 PASM staining of muskmelon pulp after infection by A.alternata (× 200)

鏈格孢侵染甜瓜顯微結(jié)構(gòu)觀察（圖2、3），伽師瓜和86-1甜瓜在0 d果皮和果肉組織切片結(jié)構(gòu)完整，沒有被侵染的現(xiàn)象；伽師瓜和86-1甜瓜侵染9 d和6 d出現(xiàn)病斑，此時病斑為組織過敏反應(yīng)，呈輕微水漬狀濕腐，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，沒有觀察到菌絲；侵染21 d，伽師瓜和86-1甜瓜的病斑直徑分別為1.76、2.26 cm，病斑周圍組織結(jié)構(gòu)被明顯破壞，存在明顯的菌絲侵入，并存在少量孢子，細(xì)胞形態(tài)遭到破壞，部分細(xì)胞壁出現(xiàn)空泡現(xiàn)象，果肉細(xì)胞菌絲入侵現(xiàn)象較為嚴(yán)重，86-1甜瓜比伽師瓜情況嚴(yán)重；侵染30 d，伽師瓜和86-1甜瓜的病斑直徑分別為2.50、3.20 cm。細(xì)胞結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，細(xì)胞壁出現(xiàn)分層、皺縮現(xiàn)象，大量菌絲侵入，并存在大量孢子，孢子萌發(fā)成菌絲，再次產(chǎn)生孢子，重復(fù)著侵染過程。病斑周圍部分未出現(xiàn)肉眼可見病斑的果肉組織（圖4），其細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)飽滿，但實際上已被鏈格孢侵入。

圖2 鏈格孢侵染甜瓜果皮PASM染色（×200）Fig.2 PASM staining of muskmelon peel after infection by A.alternata (× 200)

圖4 鏈格孢侵染兩種甜瓜第30天時非病斑果肉PASM染色（×200）Fig.4 PASM staining of non-lesion muskmelon pulp on day 30 after infection by A.alternata (× 200)

鏈格孢侵入甜瓜后，通過顯微結(jié)構(gòu)觀察伽師瓜和86-1甜瓜病斑組織，發(fā)現(xiàn)果皮和果肉組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)都遭到了不同程度的破壞，通過細(xì)胞壁增厚抵御鏈格孢侵染，果肉組織細(xì)胞壁抵抗能力較弱，侵染末期果皮與果肉組織細(xì)胞壁分層、皺縮，細(xì)胞內(nèi)侵入大量菌絲體和分生孢子，果肉組織細(xì)胞部分解體，無法辨認(rèn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

2.3 電泳檢測結(jié)果

電泳檢測CmCHT1、CmCHT2、CmGLU和CmGAPDH的PCR產(chǎn)物片段大小，片段大小符合檢測基因的片段長度，條帶單一（圖5）。

圖5 real-time PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Real-time quantitative PCR pattern

2.4 鏈格孢侵染對伽師瓜和86-1甜瓜CmCHT1相對表達(dá)量的變化

鏈格孢侵染采后伽師瓜和86-1甜瓜，果皮CmCHT1相對表達(dá)量隨貯藏時間呈升高-降低的變化趨勢（圖6A）。伽師瓜果皮CmCHT1相對表達(dá)量始終高于86-1甜瓜，接種組始終高于對照組。潛伏期至侵染初期（0～15 d）伽師瓜和86-1甜瓜果皮CmCHT1相對表達(dá)量呈升高趨勢，侵染中期（15～24 d）伽師瓜和86-1甜瓜果皮CmCHT1相對表達(dá)量在第15天和第18天最高，分別為7.20和4.18，是其對照組的3.85 倍和3.51 倍，伽師瓜是86-1甜瓜的1.72 倍，差異顯著（P＜0.05）；侵染末期（24～30 d）伽師瓜和86-1甜瓜果皮CmCHT1相對表達(dá)量降低，第30天CmCHT1相對表達(dá)量分別是2.47和2.11，是峰值的34%和51%。

圖6 鏈格孢侵染甜瓜果皮（A）和果肉（B）CmCHT1相對表達(dá)量變化Fig.6 Relative expression of CmCHT1 in melon peel (A) and pulp (B)infected by A.alternata

鏈格孢侵染采后伽師瓜和86-1甜瓜，果肉CmCHT1相對表達(dá)量隨貯藏時間呈升高-降低的變化趨勢（圖6B）。伽師瓜果肉CmCHT1相對表達(dá)量始終高于86-1甜瓜，接種組始終高于對照組。潛伏期（0～6 d）伽師瓜和86-1甜瓜果肉CmCHT1相對表達(dá)量緩慢升高，與對照組差異不顯著（P＞0.05）；侵染初期（9～15 d），伽師瓜和86-1甜瓜CmCHT1相對表達(dá)量迅速升高，伽師瓜CmCHT1相對表達(dá)量在第15天出現(xiàn)峰值為5.60，是對照組的4.17 倍，差異顯著（P＜0.05）；侵染中期（15～24 d），86-1甜瓜CmCHT1相對表達(dá)量在第18天出現(xiàn)峰值為3.80，是對照組的3.32 倍，伽師瓜峰值是86-1甜瓜的1.47 倍；侵染末期（24～30 d），伽師瓜和86-1甜瓜果肉CmCHT1相對表達(dá)量降低，30 dCmCHT1相對表達(dá)量分別為1.56和1.33，是峰值的28.00%和35.00%。

鏈格孢侵染采后伽師瓜和86-1甜瓜，兩種甜瓜果皮組織CmCHT1相對表達(dá)量均高于果肉組織，接種組高于對照組。

2.5 鏈格孢侵染對伽師瓜和86-1甜瓜CmCHT2相對表達(dá)量的變化

鏈格孢侵染采后伽師瓜和86-1甜瓜，果皮CmCHT2相對表達(dá)量隨貯藏時間呈升高-降低的變化趨勢（圖7A）。伽師瓜果皮CmCHT2相對表達(dá)量始終高于86-1甜瓜，接種組始終高于對照組。潛伏期（0～6 d），伽師瓜和86-1甜瓜果皮CmCHT2相對表達(dá)量緩慢升高；侵染初期（9～15 d），伽師瓜和86-1甜瓜果皮CmCHT2相對表達(dá)量迅速升高，在第15天出現(xiàn)峰值，分別為5.19和3.67，是對照組的3.46 倍和2.83 倍，差異顯著（P＜0.05），伽師瓜是86-1甜瓜的1.41 倍；侵染中期（15～24 d）和侵染末期（24～30 d），伽師瓜和86-1甜瓜果皮CmCHT2相對表達(dá)量迅速降低，第30天CmCHT2相對表達(dá)量分別為1.86和1.27，是峰值的36%和35%。

圖7 鏈格孢侵染甜瓜果皮（A）和果肉（B）CmCHT2相對表達(dá)量變化Fig.7 Relative expression of CmCHT2 in melon peel (A) and pulp (B)infected by A.alternata

鏈格孢侵染采后伽師瓜和86-1甜瓜，果肉CmCHT2相對表達(dá)量隨貯藏時間呈升高-降低的變化趨勢（圖7B）。伽師瓜果肉CmCHT2相對表達(dá)量始終高于86-1甜瓜（第15天除外），接種組始終高于對照組。潛伏期（0～6 d）伽師瓜和86-1甜瓜果肉CmCHT2相對表達(dá)量緩慢升高，與對照組差異不顯著（P＞0.05）；侵染初期（9～15 d），伽師瓜和86-1甜瓜果肉CmCHT2相對表達(dá)量持續(xù)升高，86-1甜瓜果肉在第15天出現(xiàn)峰值為2.71，是對照組的2.71 倍；侵染中期（15～24 d），伽師瓜果肉在第21天出現(xiàn)峰值為3.18，是對照組的2.23 倍，伽師瓜峰值是86-1甜瓜的1.17 倍；侵染末期（24～30 d），伽師瓜和86-1甜瓜果肉CmCHT2相對表達(dá)量持續(xù)降低，30 dCmCHT2相對表達(dá)量分別是1.44和1.35，是峰值的45%和48%。

鏈格孢侵染采后伽師瓜和86-1甜瓜，兩種甜瓜果皮組織CmCHT2相對表達(dá)量均高于果肉組織，接種組高于對照組。CmCHT1相對表達(dá)量在侵染初期至侵染中期較高，CmCHT2相對表達(dá)量在侵染中期表達(dá)量較高，表明病原菌在侵染初期至侵染中期誘導(dǎo)了CHT基因的表達(dá)。

2.6 鏈格孢侵染對伽師瓜和86-1甜瓜CmGLU相對表達(dá)量的變化

鏈格孢侵染采后伽師瓜和86-1甜瓜，果皮CmGLU相對表達(dá)量隨貯藏時間呈升高-降低的變化趨勢（圖8A）。伽師瓜果皮CmGLU相對表達(dá)量始終高于86-1甜瓜，接種組始終高于對照組。潛伏期（0～6 d）伽師瓜和86-1甜瓜果皮CmGLU相對表達(dá)量緩慢升高；侵染初期（9～15 d）伽師瓜和86-1甜瓜果皮CmGLU相對表達(dá)量在第15天迅速升高，分別是其對照組的3.77 倍和2.71 倍，差異顯著（P＜0.05）；侵染中期（15～24 d）伽師瓜和86-1甜瓜果皮CmGLU相對表達(dá)量在第18天和第21天最高，分別為5.77和4.47，分別是對照組的4.52 倍和3.60 倍，伽師瓜是86-1甜瓜的1.29 倍；侵染末期（24～30 d）伽師瓜和86-1甜瓜果皮CmGLU相對表達(dá)量降低，第30天CmGLU相對表達(dá)量分別為2.83和2.37，是峰值的49%和53%。

圖8 鏈格孢侵染甜瓜果皮（A）和果肉（B）CmGLU相對表達(dá)量變化Fig.8 Relative expression of CmGLU in melon peel (A) and pulp (B)infected by A.alternata

鏈格孢侵染采后伽師瓜和86-1甜瓜，果肉CmGLU相對表達(dá)量隨貯藏時間呈升高-降低的變化趨勢（圖8B）。伽師瓜果肉CmGLU相對表達(dá)量始終高于86-1甜瓜，接種組始終高于對照組，差異顯著（P＜0.05）。潛伏期（0～6 d）伽師瓜和86-1甜瓜果肉CmGLU相對表達(dá)量緩慢升高；侵染初期（9～15 d），伽師瓜和86-1甜瓜果肉CmGLU相對表達(dá)量持續(xù)升高；侵染中期（15～24 d），伽師瓜和86-1甜瓜果肉CmGLU相對表達(dá)量在第18天和第24天出現(xiàn)峰值，分別為4.29和2.68，是對照組的3.49 倍和2.37 倍；侵染末期（24～30 d）伽師瓜和86-1甜瓜果肉CmGLU相對表達(dá)量降低，第30天時CmGLU相對表達(dá)量分別為2.27和1.32，是最高峰值的53%和49%。

鏈格孢侵染采后伽師瓜和86-1甜瓜，兩種甜瓜果皮組織CmGLU相對表達(dá)量均高于果肉組織，接種組高于對照組。CmGLU相對表達(dá)量在侵染中期至侵染后期表達(dá)量較高，表明病原菌在侵染中期至侵染末期誘導(dǎo)了GLU基因的表達(dá)。

2.7 鏈格孢侵染伽師瓜和86-1甜瓜CHT活性的變化

鏈格孢侵染采后伽師瓜和86-1甜瓜，果皮CHT活性隨貯藏時間呈升高-降低的變化趨勢（圖9A），伽師瓜果皮CHT活性始終高于86-1甜瓜，接種組始終高于對照組，差異顯著（P＜0.05）。侵染中期（15～24 d）伽師瓜和86-1甜瓜分別于第18天和第21天出現(xiàn)CHT活性峰值，分別為166.65 U和89.49 U，是其對照組的2.23 倍和2.86 倍，差異顯著（P＜0.05）。

圖9 鏈格孢侵染甜瓜果皮（A）和果肉（B）CHT活性變化規(guī)律Fig.9 Changes in CHT activity in melon peel (A) and pulp (B) infected by A.alternaria

鏈格孢侵染采后伽師瓜和86-1甜瓜，果肉CHT活性隨貯藏時間呈升高-降低的變化趨勢（圖9B），伽師瓜果肉CHT活性始終高于86-1甜瓜，接種組始終高于對照組，差異顯著（P＜0.05）。侵染中期（15～24 d）伽師瓜和86-1甜瓜果肉CHT活性持續(xù)升高，第21天出現(xiàn)活性峰值，分別為92.46 U和53.10 U，是其對照組的2.48 倍和2.34 倍，差異顯著（P＜0.05）。

鏈格孢侵染采后伽師瓜，果皮組織CHT活性高于果肉，接種組高于對照組，差異顯著（P＜0.05）。侵染中期（15～24 d）果皮和果肉組織在第18天和第21天出現(xiàn)活性峰值，果皮是果肉組織活性峰值的1.80 倍，差異顯著（P＜0.05）。鏈格孢侵染采后86-1甜瓜，果皮組織CHT活性高于果肉，接種組高于對照組，差異顯著（P＜0.05）。侵染中期（15～24 d），果皮和果肉組織CHT活性在第21天出現(xiàn)峰值，果皮是果肉組織的1.69 倍，差異顯著（P＜0.05）。

2.8 鏈格孢侵染甜瓜果實GLU活性變化規(guī)律

鏈格孢侵染采后伽師瓜和86-1甜瓜，果皮GLU活性隨貯藏時間呈升高-降低的變化趨勢（圖10A）。伽師瓜果皮GLU活性始終高于86-1甜瓜，接種組始終高于對照組，差異顯著（P＜0.05）。侵染中期（15～24 d），伽師瓜和86-1甜瓜于第18天和第21天出現(xiàn)GLU活性峰值27.73 U和14.73 U，是對照組的2.89 倍和2.86 倍，差異顯著（P＜0.05）。

圖10 鏈格孢侵染甜瓜果皮（A）和果肉（B）GLU活性變化規(guī)律Fig.10 Changes in GLU activity in melon peel (A) and pulp (B)infected by A.alternata

鏈格孢侵染采后伽師瓜和86-1甜瓜，果肉GLU活性隨貯藏時間呈升高-降低的變化趨勢（圖10B）。伽師瓜果肉GLU活性始終高于86-1甜瓜，接種組始終高于對照組，差異顯著（P＜0.05）。潛伏期（0～6 d）果肉GLU活性緩慢升高，伽師瓜與對照組差異顯著（P＜0.05），86-1甜瓜與對照組差異不顯著（P＞0.05）；侵染中期（15～24 d），伽師瓜和86-1甜瓜果肉GLU活性持續(xù)升高，第21天出現(xiàn)活性峰值分別為15.35 U和5.58 U，是對照組的2.98 倍和2.85 倍，差異顯著（P＜0.05）。

鏈格孢侵染采后伽師瓜，果皮組織GLU活性高于果肉，接種組高于對照組，差異顯著（P＜0.05）。侵染中期（15～24 d），果皮和果肉組織分別在第18天和第21天出現(xiàn)活性峰值，果皮是果肉組織活性峰值的1.76 倍，差異顯著（P＜0.05）。鏈格孢侵染采后86-1甜瓜，果皮組織GLU活性高于果肉，接種組高于對照組，差異顯著（P＜0.05）。侵染中期（15～24 d）果皮和果肉組織GLU活性在第21天出現(xiàn)活性峰值，果皮是果肉組織的2.64 倍，差異顯著（P＜0.05）。說明與86-1甜瓜相比，伽師瓜能更迅速啟動防御反應(yīng)。

3 討 論

鏈格孢菌為卵形或橢圓形分生孢子，一些有細(xì)的淺棕色喙，單孢子培養(yǎng)物會產(chǎn)生黑褐色[20]。研究發(fā)現(xiàn)，采后自然發(fā)病（黑斑?。烘湼矜咔秩荆┑奶鸸瞎麑嵄砥ず稚猩园枷莸膱A斑，外有淡褐色暈環(huán)，有的內(nèi)生輪紋，病斑呈黑褐色至黑色的霉?fàn)钗?，果肉壞死，黑色，海綿狀，與健肉易分離[21]。本研究伽師瓜和86-1甜瓜病斑組織發(fā)病規(guī)律與其相似。本研究鏈格孢侵染采后甜瓜，伽師瓜病斑直徑小于86-1甜瓜，果皮病斑直徑小于果肉，說明較86-1甜瓜而言，伽師瓜具有更強的抵御鏈格孢侵染的能力，果皮比果肉組織具有更高的抗菌能力，與鏈格孢侵染對厚皮甜瓜抗菌物質(zhì)及活性氧代謝相關(guān)酶活性研究結(jié)果相似[22-23]。

細(xì)胞壁是植物病原真菌進(jìn)入寄主植物并與之直接接觸的先鋒結(jié)構(gòu)[24]。通過病斑組織顯微結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)鏈格孢侵染甜瓜中后期，果皮細(xì)胞壁增厚，果肉細(xì)胞壁部分解體，而與病斑組織交界處的果肉組織未出現(xiàn)肉眼可見病斑，但實際上已被鏈格孢分生孢子梗和分生孢子侵入。采后甜瓜果實一旦發(fā)生了黑斑?。ㄦ湼矜咔秩荆?，病原菌會借助果實充足的營養(yǎng)環(huán)境，慢慢延伸擴(kuò)散，導(dǎo)致霉菌毒素的積累，即使肉眼觀察看似未被感染，但病菌毒素已擴(kuò)散，從而導(dǎo)致其致病性和毒力[25]。研究發(fā)現(xiàn)，鏈格孢毒素在溫州蜜橘果實中日益積累，除了在病斑周圍，在非病斑部位也能檢測出[26]。表明看似健康正常的果肉，也存在嚴(yán)重的食品安全風(fēng)險，在鮮食和加工過程中削去了霉?fàn)€部分，菌絲極有可能已經(jīng)侵入果實的內(nèi)部。

植物通過細(xì)胞表面受體識別“植物-病原菌”相關(guān)分子模式并啟動防衛(wèi)反應(yīng)[27-28]，抵抗病原菌的侵入與擴(kuò)展[29]。在正常情況下，植物體內(nèi)的CHT和GLU基因以低水平表達(dá)，但在病原菌侵染、誘導(dǎo)物刺激及各種傷害下可誘導(dǎo)植物CHT和GLU基因表達(dá)，引起病原菌菌絲裂解表現(xiàn)出抗病性[10]。研究表明，霜霉病菌接種處理顯著誘導(dǎo)了CHT基因在大白菜抗病品種中的表達(dá)[30]，哈密瓜受到青霉菌侵染后，CHT基因在侵染前期發(fā)揮積極作用[31]。在本研究中，與對照組比較，受到鏈格孢侵染的伽師瓜和86-1甜瓜的果皮和果肉組織，CmCHT1、CmCHT2、CmGLU相對表達(dá)量都不同程度升高，表明病原菌刺激了病程相關(guān)蛋白CHT和GLU基因的表達(dá)，而在健康植物中不存在或者微弱表達(dá)。

CHT和GLU作為兩類重要的病程相關(guān)蛋白[32-33]，鏈格孢侵染采后伽師瓜和86-1甜瓜，伽師瓜CHT和GLU活性明顯高于86-1甜瓜，果皮CHT和GLU活性高于果肉，在侵染中期和末期保持較高水平，說明病原菌在侵染中期和末期刺激了CHT和GLU的產(chǎn)生，使其提高自身活力降解病原菌細(xì)胞壁中的多糖，從而起到抗病作用。

在甜瓜收獲時，農(nóng)戶為了縮短采摘時間，通常一人在田間摘下甜瓜，采取投、拋的方式運送至另一人手中，其果皮可能伴隨著肉眼難以察覺的破壞，如完整的蠟質(zhì)層、角質(zhì)層被劃傷，出現(xiàn)裂縫，而病原微生物能夠通過這些傷口侵入果實內(nèi)部，使甜瓜發(fā)生病害，在本研究中，通過顯微結(jié)構(gòu)觀察果皮和果肉組織受病原菌侵染后病斑擴(kuò)展情況，分析病程相關(guān)蛋白基因表達(dá)及酶活性變化規(guī)律，明確了果皮在抵抗病原菌侵染過程中的首要作用，因此在采收甜瓜時，應(yīng)適當(dāng)增加對甜瓜果皮結(jié)構(gòu)的保護(hù)，減少甜瓜病害發(fā)生。

4 結(jié) 論

鏈格孢侵染采后甜瓜，伽師瓜和86-1甜瓜分別在第9天和第6天出現(xiàn)病斑，之后不斷擴(kuò)大，86-1甜瓜病斑直徑始終大于伽師瓜，果肉大于果皮，侵染30 d，86-1甜瓜果肉和果皮的病斑直徑是伽師瓜的1.28 倍和1.29 倍，伽師瓜抵抗鏈格孢侵染的能力強于86-1甜瓜。

鏈格孢侵入甜瓜后，果皮和果肉組織通過細(xì)胞壁增厚抵御鏈格孢侵染，果肉組織抵抗能力較弱，侵染末期果皮與果肉組織細(xì)胞內(nèi)侵入大量菌絲體和分生孢子，部分細(xì)胞解體，無法辨認(rèn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

鏈格孢侵染采后甜瓜，CmCHT1、CmCHT2、CmGLU相對表達(dá)量和CHT活性、GLU活性明顯提高，呈升高-降低趨勢，伽師瓜峰值均高于86-1甜瓜，果皮高于果肉，峰值多在15～21 d出現(xiàn)，因此相比于86-1甜瓜，伽師瓜能夠更迅速響應(yīng)鏈格孢菌侵染，果皮抵抗能力更強，能快速、大量產(chǎn)生抗病蛋白，在侵染中期（15～24 d）作用顯著。證實病程相關(guān)蛋白在甜瓜抗鏈格孢侵染中的關(guān)鍵作用。