GC-MS和LC-MS/MS分析麥粉中烷基間苯二酚同系物組成

黃沁沁，樊鳳嬌，李 彭，樊 艷，鄒燕羽，方 勇

（南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210023）

烷基間苯二酚（alkylresorcinols，ARs）是一類存在于植物、藻類以及某些微生物體內的酚類脂質[1-2]。在人們日常膳食中，ARs主要存在于小麥、黑麥等麥類作物麩皮中，根據其飽和度和烷基側鏈的碳原子個數可以分為5-十五烷基間苯二酚（C15:0）、5-十七烷基間苯二酚（C17:0）、5-十九烷基間苯二酚（C19:0）、5-二十一烷基間苯二酚（C21:0）、5-二十三烷基間苯二酚（C23:0）和5-二十五烷基間苯二酚（C25:0）等同系物[3]。ARs因具有抗氧化[4]、抑菌[5]、抑制腫瘤[6]作用等多種生理功能，逐漸受到研究者的關注。近年來，隨著人們對飲食健康的重視度不斷提高，全谷物產品由于其豐富生理活性物質，如膳食纖維、礦物質、酚類物質、維生素等帶來的健康效應，逐漸受到消費者的喜愛[7-8]。然而目前麥類作為全谷物加工食品主要來源，其產品缺少可識別的特征標記和質量標準，有不法分子將小麥粉冒充全麥粉，嚴重影響到我國全麥粉市場秩序[9]。已有研究表明ARs特異性地存在于麥類麩皮中，而在小麥胚乳或者無麩皮的膳食中，無法檢測到ARs的存在，可作為判斷全麥粉食品的生物標記物[10-11]。因此建立一種快速便捷、靈敏準確的分析方法測定麥粉中ARs，對規范我國全麥粉市場具有重要的現實意義。

目前關于麥粉中ARs的分析方法主要有比色法、氣相色譜法、氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法等[11]。由于麥粉的基質復雜性，需要先對目標物ARs進行富集，常見的富集方法包括液液萃取[12]和固相微萃取[13]等。Chen Yan等[14]對ARs同系物進行衍生化處理，結果發現衍生處理可以有效降低ARs同系物的氣化溫度和沸點，使目標物（C15:0～C25:0）在60～320 ℃升溫程序過程中均可被檢測出來。隨著質譜的應用，GC法后期發展成GC-MS法，靈敏度和檢測限顯著提高。Gambanelli等[15]對脫殼小麥中ARs進行測定，發現ARs飽和同系物以C17:0～C25:0為主，3 個不飽和同系物為C19:1、C19:2、C21:1。Liu Lei等[16]建立了麥麩中ARs定量分析的LC-MS法，結合使用選擇離子監測（selected ion monitor，SIM）模式進行測定，結果發現該方法檢出限為5 ng/g，定量限為15 ng/g，滿足其檢測要求。近年來，質譜技術逐漸由單級質譜向串聯質譜發展，質譜串聯后選擇性增強，靈敏度和檢測限進一步提高。Kn?dler等[17]使用LC-MS/MS對多種小麥中ARs進行檢測，發現總量為430～1 077 mg/kg。目前相關文獻主要單獨應用GC-MS或LC-MS/MS檢測技術對小麥和小麥制品中ARs進行測定，鮮見涉及2 種不同方法的對比。因此，如果對2 種方法進行比較，明確二者在ARs測定方法的差異，將為后期合理選擇麥粉中ARs的檢測技術提供理論依據。

本研究通過比較GC-MS和LC-MS/MS兩種測定ARs同系物的檢測方法，優化樣品前處理、儀器條件等參數并對麥粉制品中ARs同系物組分進行定量分析和方法評估，研究結果對建立有效、穩定的ARs同系物組成的檢測分析技術、全麥粉產品真偽判別和麥類全谷物產品品質控制方面具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥粉樣品：國內不同品牌全麥粉共20 種、小麥粉共15 種，所有國內麥粉均購自南京市各大超市及網購品種；國外不同品牌全麥粉20 種、小麥粉15 種，所有國外麥粉均購自美國和加拿大超市（包括來自美國、加拿大、法國、英國等共22 個麥粉品牌）。

5-十五烷基間苯二酚（C15:0）、5-十七烷基間苯二酚（C17:0）、5-十九烷基間苯二酚（C19:0）、5-二十一烷基間苯二酚（C21:0）和5-二十三烷基間苯二酚（C23:0）標準品（純度≥95%）、N,O-雙(三甲基硅)三氟乙酰胺（含三甲基氯硅烷） 美國Sigma公司；甲醇、乙腈、正己烷、乙醇、乙酸乙酯（均色譜純） 德國Merck公司；其他試劑均為國產分析純；實驗所用水均為超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm）。

5 種ARs標準品分別準確稱取5 mg，用5 mL甲醇溶解并定容，分別配制成質量濃度為1 mg/mL標準儲備液；準確吸取各ARs標準儲備液1 mL至10 mL容量瓶中，使用乙酸乙酯定容，得到質量濃度為100 μg/mL混合標準中間液。

1.2 儀器與設備

7890A-5975氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司；H-Class/Xevo TQ-S液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀美國Waters公司；CPA225D分析天平 蘇州賽恩斯儀器有限公司；JY 98-IIIN超聲波細胞粉碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；Hei-VAP Precision旋轉蒸發儀德國Heidolph公司；SC-3616低速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；8位干式氮吹儀 博納艾杰爾科技公司；FOTECTOR-02HT全自動固相萃取儀 睿科集團股份有限公司；CLEANERT S 500 mg/6 mL高純球型硅膠反相C18固相萃取柱 天津博納艾杰爾科技有限公司；0.22 μm有機濾膜 天津市科億隆實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GC-MS分析條件

GC條件：DB-17HT毛細管耐高溫氣相色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氦氣，流量為1 mL/min；升溫程序：初始溫度150 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升溫到320 ℃，保持7 min，以5 ℃/min升溫至325 ℃，保持8 min；進樣方式為分流進樣，分流比為10∶1；溶劑延遲2 min；進樣口溫度280 ℃。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度300 ℃；四極桿溫度150 ℃；質量掃描范圍m/z35～650。采用RTLPEST3.L和NIST08.L工作站收集數據，通過NIST08.L譜庫和化學結構式進行比較。

1.3.2 LC-MS/MS分析條件

LC條件：ACQMITY MPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫30 ℃；進樣量5 μL；流動相：A相為含0.1%（體積分數）的氨水，B相為乙腈；流速0.5 mL/min；洗脫梯度：0～2 min，100%～15% A，0%～85% B；2～4 min，15%～10% A，85%～90% B；4～8 min，10%～5% A，90%～95% B；8～9 min，5%～15% A，95%～85% B。

MS條件：電噴霧離子源，負離子源；多反應監測模式；毛細管電壓1.2 kV；錐孔氣流：氮氣，流速150 L/h；離子源溫度150 ℃；去溶劑氣溫度200 ℃，流速1 000 L/h。多反應監測離子對及質譜相關參數見表1。

表1 ARs同系物的保留時間、監測離子及LC-MS/MS質譜采集參數Table 1 Retention time, monitoring ion and mass spectral acquisition parameters of alkylresorcinols homologues in LC-MS/MS

1.3.3 樣品前處理

1.3.3.1 提取

參考鄒燕羽等[18]的方法，并稍作修改。稱取麥粉樣品1.0 g（精確至0.001 g）于50 mL離心管中，加入40 mL乙酸乙酯，采用超聲細胞破碎儀進行超聲提取實驗，超聲功率600 W提取2 min，3 500 r/min離心5 min。重復上述操作2 次，合并上清液，將上清液于45 ℃進行旋轉蒸發至近干，加入20 mL乙酸乙酯回溶。

1.3.3.2 衍生化處理

準確吸取1.3.3.1節回溶溶液5 mL加入10 mL離心管，加入30 μL衍生劑，蓋緊瓶蓋，渦旋混勻后在60 ℃條件下水浴30 min后，將衍生液過0.22 μm有機濾膜后，轉移至進樣小瓶待GC-MS分析（標準溶液重復上述步驟進行衍生化處理）。

1.3.3.3 固相萃取凈化處理

向C18固相萃取柱中加入4 mL甲醇和4 mL超純水使柱子活化，取1.3.3.1節濃縮液5 mL，裝載至萃取柱，用4 mL體積分數10%甲醇溶液淋洗，再用5 mL甲醇洗脫，洗脫速率控制為2 mL/min，甲醇洗脫液接收至10 mL離心管中，洗脫液經氮氣吹近干，用乙腈定容至5.0 mL，過0.22 μm有機濾膜后，轉移至進樣小瓶待LC-MS/MS分析。

2 結果與分析

2.1 提取方法的選擇

麥粉中ARs提取溶劑通常選用正丙醇、乙酸乙酯、甲醇和丙酮等多種有機溶劑[19-21]進行提取，因此本研究首先對提取溶劑進行優化。甲醇、丙酮與水的互溶性較強，通過實驗發現其回收率較低，這是因為其極易將麥粉中的水溶性蛋白提取出來，產生較多雜質，不利于后續凈化實驗[22]。而正丙醇實驗對ARs的回收率在80%以下。ARs作為雙親分子，其極性與乙酸乙酯相近，且其萃取液中共提物少，為最佳萃取溶劑，實驗結果表明待測物回收率達80%以上，基線干擾小。目前糧食行業標準[23]對于全麥粉中ARs的提取方式主要采用振蕩48 h。超聲作為一種目前使用廣泛的提取工藝，可以通過空化效應，增強功能活性物質的提取效果[24]。經過實驗室前期超聲提取工藝優化實驗，發現超聲提取條件的提取率高達87%，因此后續實驗選擇超聲輔助乙酸乙酯進行提取。

2.2 GC-MS分析條件的優化

2.2.1 衍生條件的選擇

本研究中目標化合物ARs含有酚羥基，極性較高，沸點較高，在傳統GC法分離效果較差。如果采用硅烷衍生化，可將酚羥基化合物與硅烷化試劑反應生成極性小、熱穩定性好、易揮發的硅烷衍生物，從而進行GC分析[14]。N,O-雙(三甲基硅)三氟乙酰胺（含三甲基氯硅烷）試劑作為常見的衍生劑，反應條件溫和、反應速率高，為了選擇較優的衍生化條件，本研究比較了60 ℃條件下經不同衍生時間（0～50 min）和衍生劑體積（0～40 μL）的衍生效果。如圖1A所示，隨著衍生反應時間的延長，峰面積出現先上升后降低的趨勢，而隨著衍生劑體積的增加（圖1B），峰面積出現了上升而趨于穩定的結果。這表明，衍生劑加入過量對衍生產物并沒有促進作用，然而衍生時間產生的作用可能是由于加熱的不斷進行，從而導致衍生劑發生變化。因此，為防止目標化合物降解，保障其最佳的衍生化效率，本實驗確定最佳衍生化時間為30 min，衍生劑體積為30 μL。

圖1 GC-MS法中衍生處理時間（A）和衍生劑體積（B）對峰面積的影響Fig.1 Effect of derivatization time (A) and derivatization agent volume (B) on peak area in GC-MS

2.2.2 儀器條件的選擇

將5 種目標物的衍生物在m/z35～650范圍內進行全掃描，獲得總離子監測模式中各種ARs的保留時間。根據各物質的標準版質譜圖，選擇豐度高、質荷比大、不與碎片離子相同的離子作為特征離子，各物質的保留時間和定性、定量離子見表2。結果發現定性離子為m/z268為所有離子中相對豐度最高的離子。這是因為含有酚羥基的苯環在經過衍生化處理之后，三甲基硅醚基團取代苯環上羥基在通過質譜電離的作用下，酚羥基形成了特定的m/z268離子，這與之前文獻報道結果一致[11]，為更好分析目標物，后續實驗測定均采用SIM（m/z268），這也是目前ARs的GC-MS/SIM法測定的主要依據[25-27]。

表2 GC-MS質譜采集參數Table 2GC-MS acquisition parameters of alkylresorcinols

在優化的分離條件下，目標化合物衍生物在GC-MS/SIM經過檢測后，得到圖2。從圖2可以看出，C15:0～C23:0可以較好分布于12～18 min，目標物的峰形較好，分離效果好，適用于目標化合物的檢測。

圖25 種ARs同系物標準品GC-MS/SIMFig.2 Selective ion monitoring chromatogram of five homologues of alkylresorcinols in GC-MS

2.3 LC-MS/MS法分析條件的優化

2.3.1 色譜條件的優化

2.3.1.1 色譜柱的選擇

ARs同系物作為雙親性化合物，含有許多極性基團，根據實驗室前期的實驗結果[18]，ARs在色譜柱C18柱中具有較好的保留效果，因此實驗選擇C18柱。

2.3.1.2 流動相的選擇

乙腈作為最常見的流動相，據前期研究基礎[18]，可以對ARs同系物進行有效分離。在LC-MS/MS中，還需考慮流動相對質譜離子化效率的影響，本研究選擇了氨水作為流動相，以提高負離子化。當氨水濃度過高時候，易與空氣中CO2結合，形成碳酸銨沉淀，因此考察氨水體積分數對ARs同系物保留和相應情況，當選擇氨水體積分數為0.05%時，ARs類可以有效分離，但峰形較低矮圓潤，峰形對稱不完全，拖尾比較嚴重；當氨水體積分數為0.2%時，色譜峰有效分離，但峰形對稱尖銳，仍有拖尾現象，最終發現體積分數0.1%氨水響應值、峰形和分離效果比較完美，滿足實驗需求。

2.3.2 質譜條件的優化

ARs作為雙親性分子，含有酚羥基結構，可以失去質子，因此選擇電噴霧離子源負離子掃描模式，配制質量濃度為100 ng/mL的ARs同系物混標，對待測物進行全掃描（m/z35～650），選擇質荷比響應最強的碎片離子作母離子，對錐孔電壓進行優化，母離子的豐度達到最優。通過子離子掃描，篩選2 個特征碎片離子，優化碰撞電壓，并選取豐度較高的子離子作為定量離子（圖3）。

圖3 LC-MS/MS法中ARs同系物的多反應監測色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of alkylresorcinol homologues in LC-MS/MS

2.3.3 固相萃取工藝優化

首先考察洗脫溶劑對ARs同系物回收率的影響。如圖4A所示，ARs同系物的甲醇洗脫效率均在84%以上，要高于其他洗脫試劑，后續進一步考察洗脫流速和淋洗比例等對ARs同系物洗脫效果的影響。如圖4B、C所示，隨著流速、體積的增加，ARs同系物的洗脫效率均出現先提高后降低的趨勢，因此后續實驗選擇流速2 mL/min和洗脫體積為5 mL。此外，圖4D還發現甲醇的淋洗比例從0%升至5%，僅有C21:0的洗脫效率出現增加，其他同系物的洗脫效率均出現降低，這可能是低濃度的甲醇難以洗脫ARs，隨著淋洗比例從5%升至10%，ARs洗脫效率均出現迅速增加，當淋洗比例從10%升至20%，ARs同系物的回收率出現降低趨于平穩的趨勢，因此在2 mL/min的流速下，選擇淋洗比例為10%的甲醇溶液洗脫體積5 mL。

圖4 LC-MS/MS法中洗脫溶劑（A）、洗脫流速（B）、洗脫體積（C）和淋洗比例（D）對ARs的回收率影響Fig.4 Effects of elution solvents (A), flow rate (B), elution volume (C) and washing solvent composition (D) on the recoverites of alkylresorcinols in LC-MS/MS

2.4 GC-MS與LC-MS/MS的方法比較

2.4.1 線性關系與檢出限

根據優化的GC-MS及LC-MS/MS方法，對系列質量濃度ARs各同系物的混標溶液進行分析。以質量濃度作為橫坐標，根據相應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結果如表3所示。GC-MS和LC-MS/MS的測定范圍均在0.001～5 μg/mL之間，除了LC-MS/MS的C19:0相關系數為0.988 0，其他待測物的相關系數均大于0.99，這表明具有良好的線性關系，檢出限均低于10 μg/g。

表3 GC-MS、LC-MS/MS法測定5 種ARs同系物線性方程、相關系數、檢出限及定量限Table 3 Linear equations, correlation coefficients, detection limits and quantification limits of GC-MS and LC-MS/MS for five alkylresorcinol homologues

相比較固相萃取-LC-MS/MS，GC-MS的檢出限更低，可能是由于特定離子衍生化掃描的結果，而固相萃取-LC-MS/MS由于分離和純化的效果較好，使保留時間更短，完成樣品測量時間更少。

2.4.2 準確度及精密度結果

如圖5所示，樣品中ARs同系物在GC-MS和LC-MS/MS譜圖中峰形較好，分離效果好，2 種方法均可用于樣品檢測。在GC-MS的選擇離子掃描色譜圖中，C19:0和C21:0出峰位置后發現了相應的不飽和同系物（如C19:1和C21:1等），但含量相對偏少，因此本研究不討論不飽和同系物含量變化。后續按照樣品實際質量濃度設計加標質量濃度，每個質量濃度做6 次平行，使用GC-MS和LC-MS/MS對其測定，計算出平均加標回收率，然后對相對標準偏差進行計算。

圖5 麥粉樣品在GC-MS測定中的選擇離子掃描色譜圖（A）和LC-MS/MS測定中液相色譜圖（B）Fig.5 GC-MS chromatogram (A) and LC-MS/MS liquid chromatogram (B) of wheat flour sample

選取小麥粉和全麥粉進行加標回收實驗。如表4所示，各方法的加標回收率均在89.05%～99.15%之間；相對標準偏差均在5%以下，說明2 種方法的準確性和精密度良好，但是采用GC-MS中未在樣品中檢測出C15:0同系物，這可能是由于樣品實際基質的復雜性，超聲難以將其提出，從而使衍生化處理后難以檢測。而在LC-MS/MS測定之前經過固相萃取優化后，極大程度減少了基質對C15:0的影響，從而更易被檢出。

表4 GC-MS、LC-MS/MS法測定ARs同系物的加標回收率和相對標準偏差（n=6）Table 4 Spiked recoveries and RSDs of alkylresorcinol homologues by GC-MS and LC-MS/MS (n= 6)

2.4.3 實際樣品的測定

后續采用GC-MS和LC-MS/MS兩種方法對國內外70 種麥粉樣品中ARs同系物含量進行分析。如表5所示。通過GC-MS測定的國內外全麥粉含量最高達1 043.9 μg/g和1 375.2 μg/g，要低于LC-MS/MS測定的ARs最高含量為1 157.4 μg/g和1 535.2 μg/g，這可能與樣品中C15:0在GC-MS未檢出有關。國內全麥粉ARs總量波動較大，最低值要顯著低于國外全麥粉含量，這可能與國內全麥粉標準缺少有關。Ross等[2]報道稱國外的全麥粉配方中會明確提及ARs含量及配比，而國內缺少相應的標準，整體國內全麥粉中ARs含量低于國外全麥粉，因此有必要對國內全麥粉市場進行規范。在LC-MS/MS檢測的小麥粉樣品均未檢測出C15:0，這可能與麥粉產品精加工有關系。在所有產品中，發現50%左右ARs含量均為C21:0，這與文獻報道一致[28-29]，這表明C21:0是ARs主要的同系物。

表5 不同分析方法對實際小麥樣品中ARs同系物的測定結果Table 5 Results for determination of alkylresorcinol homologues in actual wheat samples by different analytical methods

3 結 論

建立GC-MS與LC-MS/MS兩種分析國內外麥粉中ARs同系物的方法，對比了2 種方法的差異性。結果表明，2 種檢測方法線性關系較好、檢測限較低、靈敏度較高、測定結果準確，均可作為麥粉中ARs同系物的定性和定量分析方法。對于GC-MS來說，雖然可以采用選擇離子掃描方式降低方法檢出限，但衍生處理時間較長，浪費試劑；對于LC-MS/MS來說，準確度高，分析時間較短，本法可以作為麥粉中ARs含量測定的優選方法。