T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)在AIDS/TB人群中的診斷價(jià)值

姚正鋼 陳勇毅 藍(lán)夢(mèng)穎

結(jié)核感染是艾滋病常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性感染，結(jié)核病與艾滋病相互促進(jìn)病變進(jìn)展、惡化、加速導(dǎo)致患者死亡，HIV陽(yáng)性患者感染結(jié)核菌后，結(jié)核病發(fā)病率較HIV陰性者高30倍，結(jié)核病已成為艾滋病毒感染者/艾滋患者中的一個(gè)主要死因[1]，早期診斷并進(jìn)行及時(shí)有效的治療對(duì)艾滋病合并結(jié)核病的預(yù)后至關(guān)重要[2]。艾滋病合并繼發(fā)性肺結(jié)核（AIDS/TB）患者肺結(jié)核的臨床表現(xiàn)不典型、肺部影像學(xué)不特異、痰涂片找抗酸桿菌陽(yáng)性率低，在基層醫(yī)院易漏診、誤診，特別是早期診斷較為困難[3]。結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)（tuberculosis T cell spot detection, T-SPOT.TB）及Gene Xpert MTB /RIF近年在臨床得到推廣，對(duì)提高肺結(jié)核診斷的準(zhǔn)確性有較大的幫助[4-5]，由于這兩種方法在艾滋病合并繼發(fā)性肺結(jié)核研究較少，本研究通過(guò)對(duì)本院就診患者的資料進(jìn)行分析，探討T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB /RIF在艾滋病合并繼發(fā)性肺結(jié)核人群的診斷價(jià)值，以期為臨床提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取 2019年1 月—2020年9 月在我院就診的疑似肺結(jié)核患者323例的資料進(jìn)行分析，所有納入病例均進(jìn)行T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB /RIF、痰涂片找抗酸桿菌、痰結(jié)核菌培養(yǎng)、抗HIV、CD4+淋巴細(xì)胞檢查。所有入組患者均已獲取知情同意，且簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。根據(jù)臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)檢查、病理學(xué)結(jié)果，按照診斷標(biāo)準(zhǔn)，將符合入組條件的病例分成兩組：繼發(fā)性肺結(jié)核患者（TB）組及艾滋病合并繼發(fā)性肺結(jié)核患者（AIDS/TB）組。診斷標(biāo)準(zhǔn)：艾滋病的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國(guó)艾滋病診療指南（2018版）》[6]， 肺結(jié)核的診斷參照《肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn) （WS288-2017）》[7]。繼發(fā)性肺結(jié)核確診標(biāo)準(zhǔn)：具備繼發(fā)性肺結(jié)核影像學(xué)表現(xiàn)特征且符合以下條件之一：（1）2份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽(yáng)性；（2）分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性，菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群；（3）結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)陽(yáng)性；（4）肺組織或肺外組織病理學(xué)檢查證實(shí)為結(jié)核病變。AIDS/TB組，除符合TB組的條件外，還要符合以下條件：（1）HIV抗體篩查試驗(yàn)陽(yáng)性和HIV補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性；（2）CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)＜350個(gè)/μL。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡大于18歲；（2）肺結(jié)核初治；（3）知情同意，能配合完成相關(guān)檢查者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）免疫抑制劑和免疫增強(qiáng)劑使用者；（2）合并其他免疫功能異常疾病者；（3）合并其他嚴(yán)重感染者。最終符合入組的患者209例，AIDS/TB組77例，TB組132例。

1.2 研究方法

1.2.1 T-SPOT.TB檢測(cè)方法 試劑盒購(gòu)自廣東希格生物科技有限公司。抽取患者外周靜脈血5 mL，加至含肝素的采血管中，然后按照T-SPOT.TB試劑盒的使用說(shuō)明操作，陽(yáng)性判斷值參考說(shuō)明書：當(dāng)N孔斑點(diǎn)數(shù)≤10，P孔斑點(diǎn)數(shù)≥20或P孔斑點(diǎn)數(shù)≤19，T孔-N孔斑點(diǎn)數(shù)≥11為陽(yáng)性；當(dāng)11≤N孔斑點(diǎn)數(shù)≤20，P孔斑點(diǎn)數(shù)≥20或P孔斑點(diǎn)數(shù)≤19，T孔-N孔斑點(diǎn)數(shù)≥N為陽(yáng)性；當(dāng)N孔斑點(diǎn)數(shù)＞20，結(jié)果判斷不確定。

1.2.2 Gene Xpert MTB/RIF檢測(cè) Gene Xpert及測(cè)試盒購(gòu)自Cepheid公司。取研究對(duì)象1份晨痰或BALF樣本,按《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》進(jìn)行N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH消化處理,消化后的菌液重懸于1.1 mL的磷酸鹽緩沖液中，取0.5 mL用于Xpert MTB/RIF系統(tǒng)檢測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)

各組病例T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB/RIF、痰涂片、痰培養(yǎng)檢測(cè)陽(yáng)性率；以臨床診斷結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，四種檢測(cè)方法在AIDS/TB組患者中的敏感性及特異性；不同CD4+T水平艾滋病合并繼發(fā)性肺結(jié)核患者T-SPOT.TB、Gene Xpert結(jié)果比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷結(jié)果

最終符合入組的患者中，AIDS/TB組77例，TB組132例。AIDS/TB組77例患者中，男52例，女25例，平均年齡（45.2±15.8）歲；TB組132例患者中，男75例，女57例，平均年齡（48.4±17.3）歲。

2.2 四種不同檢測(cè)方法的陽(yáng)性率

各組病例T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB/RIF、痰涂片、痰培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。在AIDS/TB組中，四種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率分別為T-SPOT.TB79.22%（61/77），Gene Xpert MTB/RIF 54.55%（42/77）、痰涂片36.36%（28/77）、痰培養(yǎng)40.26%（31/77）；在TB組中，四種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率分別為T-SPOT.TB80.30%（106/132），Gene Xpert MTB/RIF 62.88%（83/132）、痰涂片41.67%（55/132）、痰培養(yǎng)57.58%（76/132），兩組患者同種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率比較：T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB/RIF、痰涂片陽(yáng)性率經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組患者痰培養(yǎng)陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在艾滋病合并繼發(fā)性肺結(jié)核患者中，T-SPOT.TB方法陽(yáng)性率與其他三種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），而Gene Xpert、痰涂片、痰培養(yǎng)分別與另外三種方法比較只有部分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異：Gene Xpert與痰涂片比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與痰培養(yǎng)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；痰涂片與痰培養(yǎng)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 四種檢測(cè)方法陽(yáng)性率（%）

2.3 四種檢測(cè)方法在AIDS/TB組患者中的診斷效能比較

T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB/RIF、痰涂片、痰培養(yǎng)診斷AIDS/TB組患者效能比較以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)，四種檢測(cè)方法在AIDS/TB組患者中的敏感性及特異性情況見(jiàn)表2。該組患者中T-SPOT.TB敏感性達(dá)79.22%，明顯較Gene Xpert MTB/RIF、痰涂片、痰培養(yǎng)的敏感性高，而特異性方面Gene Xpert達(dá)100%，高于其他方法。

表2 T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB/RIF、痰涂片、痰培養(yǎng)診斷艾滋病合并繼發(fā)性肺結(jié)核效能比較（%）

2.4 CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與T-SPOT.TB、Gene Xpert陽(yáng)性率

在AIDS/TB組的77例患者中，CD4+T≥200個(gè)/μL的繼發(fā)性肺結(jié)核中36例T-SPOT.TB陽(yáng)性，陽(yáng)性率59.02%，CD4+T＜200個(gè)/μL的繼發(fā)性肺結(jié)核中25例T-SPOT.TB陽(yáng)性率40.98%，兩組陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CD4+T≥200個(gè)/μL的繼發(fā)性肺結(jié)核中Gene Xpert陽(yáng)性率54.76%，CD4+T＜200個(gè)/μL的繼發(fā)性肺結(jié)核中GeneXpert陽(yáng)性率45.24%，兩組陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 不同CD4+T水平艾滋病合并患者繼發(fā)性肺結(jié)核T-SPOT.TB、Gene Xpert結(jié)果（%）

3 討論

結(jié)核病是艾滋病最常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性感染，與艾滋病互相促進(jìn)病變進(jìn)展、惡化，甚至迅速導(dǎo)致死亡。AIDS/TB患者中，繼發(fā)性肺結(jié)核的臨床癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)表現(xiàn)等與普通肺結(jié)核表現(xiàn)不一致，易造成臨床誤診漏診，如果能夠盡早明確診斷，及時(shí)規(guī)范治療后多數(shù)患者肺結(jié)核可以治愈，艾滋病預(yù)后也能改善，因此繼發(fā)性肺結(jié)核的早期診斷非常重要。目前在基層醫(yī)院，肺結(jié)核的檢測(cè)方法有限，基本限于結(jié)核菌素試驗(yàn)、痰涂片、痰培養(yǎng)及胸部影像學(xué)檢查，但結(jié)核菌素試驗(yàn)受影響因素較多，假陽(yáng)性率高，痰涂片找抗酸桿菌操作雖然簡(jiǎn)單，但檢出率低，陽(yáng)性率僅40%左右，且涂片檢出不能分辨活菌、死菌，不能鑒別結(jié)核分枝桿菌或非結(jié)核分枝桿菌[8]；結(jié)核菌培養(yǎng)可以通過(guò)觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況并進(jìn)一步進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)，但培養(yǎng)陽(yáng)性率更低，且至少需要4周，時(shí)間較長(zhǎng)，難以滿足臨床早期診斷的需求,而胸部影像學(xué)檢查缺乏特異性。因此，基層醫(yī)院需要探索更特異、敏感、快速、簡(jiǎn)單，能在基層醫(yī)院開(kāi)展的結(jié)核病診斷方法[9]。

T-SPOT.TB是將結(jié)核菌特異性抗原加入受試者的血液標(biāo)本或者含有分離出的外周血單核細(xì)胞的培養(yǎng)基中進(jìn)行孵化，如果受試者受到過(guò)結(jié)核分枝桿菌感染，那么被結(jié)核菌激活的記憶T細(xì)胞就會(huì)對(duì)這些特異性抗原產(chǎn)生反應(yīng)，發(fā)生增殖分化并釋放出γ-干擾素以及其他一些細(xì)胞因子，我們可以通過(guò)ELISA或ELISPOT方法定量檢測(cè)γ-干擾素的釋放水平，判斷是否存在結(jié)核菌感染。T-SPOT.TB在普通肺結(jié)核應(yīng)用有不少研究見(jiàn)于報(bào)道，具有高敏感性和高特異性，并且不受卡介苗和大多數(shù)非致病分枝桿菌的影響，T-SPOT.TB在結(jié)核診斷中的意義正在被越來(lái)越多的臨床實(shí)驗(yàn)所證[5]，但在艾滋病合并繼發(fā)性肺結(jié)核患者診斷應(yīng)用研究較少。艾滋病由感染艾滋病病毒（HIV病毒）引起，HIV把人體免疫系統(tǒng)中最重要的CD4T淋巴細(xì)胞作為主要攻擊目標(biāo)，大量破壞該細(xì)胞，使人體喪失免疫功能。CD4T淋巴細(xì)胞會(huì)否影響T-SPOT.TB結(jié)果，本研究通過(guò)觀察在77例艾滋病合并繼發(fā)性肺結(jié)核患者患者中，T-SPOT.TB陽(yáng)性率79.22%（61/77），普通肺結(jié)核患者T-SPOT.TB陽(yáng)性率80.30%，兩組患者陽(yáng)性率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。艾滋病組患者中T-SPOT.TB敏感性達(dá)79.22%，敏感性明顯高于Gene Xpert MTB/RIF、痰涂片、痰培養(yǎng)三種方法。本研究也觀察到艾滋病組CD4+T≥200個(gè)/μl的患者T-SPOT.TB陽(yáng)性率59.02%，CD4+T＜200個(gè)/μl患者的T-SPOT.TB陽(yáng)性率40.98%，不同CD4+T細(xì)胞水平陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，本研究觀察到CD4T淋巴細(xì)胞水平與T-SPOT.TB結(jié)果沒(méi)有明顯相關(guān)性，T-SPOT.TB在艾滋病合并活動(dòng)性肺結(jié)核患者中敏感性達(dá)79.22%，特異性89.29%，T-SPOT.TB對(duì)于診斷艾滋病合并繼發(fā)性肺結(jié)核有臨床價(jià)值[10]。但也要注意，T-SPOT.TB陽(yáng)性不能區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核感染或潛伏的結(jié)核感染，診斷時(shí)需綜合其他方法判斷，T-SPOT.TB陰性時(shí)，可排除結(jié)核菌感染，在判斷結(jié)核菌還是非結(jié)核菌感染時(shí)有較高臨床價(jià)值[11]。

Gene Xpert MTB/RIF分子診斷系統(tǒng)，是全自動(dòng)一體化的基于PCR方法的核酸檢測(cè)系統(tǒng)，基于Gene Xpert平臺(tái)的結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥檢測(cè)僅需2小時(shí)即可從原始標(biāo)本獲得結(jié)果，比傳統(tǒng)的熒光定量PCR檢測(cè)方法更準(zhǔn)確、安全、快速，生物安全性要求不高，且能同時(shí)檢測(cè)利福平耐藥，可以在基層醫(yī)院開(kāi)展[12]。本研究顯示艾滋病組患者中Gene Xpert敏感性達(dá)54.55%，特異性達(dá)100%，不同CD4+T水平患者在敏感性、特異性方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。特異性明顯高于T-SPOT.TB、痰涂片、痰培養(yǎng)三種方法，在快速診斷方面有明顯優(yōu)勢(shì)，但Gene Xpert檢測(cè)的是基因片段，無(wú)法判斷是死菌還是活菌，且由于采用痰標(biāo)本，結(jié)果受痰標(biāo)本質(zhì)量影響[13]。

綜上所述，診斷艾滋病合并活動(dòng)性肺結(jié)核時(shí)，T-SPOT.TB具有較高的敏感性，Gene Xpert有較高的特異性，兩者用于艾滋病患者合并繼發(fā)性肺結(jié)核的輔助診斷有一定的臨床價(jià)值。