病理檢驗(yàn)過(guò)程中石蠟切片及HE染色常見(jiàn)問(wèn)題及對(duì)策分析

梁津杰

石蠟切片與HE染色是病理檢驗(yàn)切片處理的主要技術(shù)手段，其處理效果對(duì)于臨床診斷有著直接的影響，質(zhì)量上乘的切片才是實(shí)現(xiàn)正確診斷的根本要求，尤其是在臨床諸多重大疑難病理的診斷上，必須保障高質(zhì)量的處理切片，才能獲取準(zhǔn)確診斷結(jié)果，成為臨床診療的可靠依據(jù)。但在臨床實(shí)踐中切片處理質(zhì)量差等問(wèn)題始終無(wú)法避免，因此，本次分析意在總結(jié)病理檢驗(yàn)中石蠟切片與HE染色的常見(jiàn)問(wèn)題，并根據(jù)每個(gè)問(wèn)題出現(xiàn)的原因探究針對(duì)性解決對(duì)策，以便提高石蠟切片與HE染色質(zhì)量。具體來(lái)講，本次選擇我院2018年10月—2019年10月由筆者質(zhì)控的約4 200張病理切片作為研究對(duì)象，詳細(xì)分析其切片處理以及HE染色上存在問(wèn)題及具體表現(xiàn)，并基于問(wèn)題出現(xiàn)原因給出解決對(duì)策，以供參考與借鑒。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次選擇我院2018年10月—2019年10月由筆者質(zhì)控的約4 200張病理切片作為研究對(duì)象。

1.2 石蠟切片及HE染色常見(jiàn)問(wèn)題及原因

1.2.1 石蠟切片的常見(jiàn)問(wèn)題及原因 （1）皺褶及折疊，切片內(nèi)部或者邊緣出現(xiàn)組織重疊。該問(wèn)題產(chǎn)生的原因有切片問(wèn)題也有漂片問(wèn)題，切片時(shí)如組織較硬，有鈣化灶或者異物存在，切片刀不夠鋒利，均容易形成皺褶，蠟塊冷卻不足、較軟也容易出現(xiàn)皺褶，漂片時(shí)水溫過(guò)低，組織切片在溫水中不能完全展開(kāi)，也會(huì)形成皺褶。 （2）切片散開(kāi)，漂片過(guò)溫水的時(shí)候，切片向四周擴(kuò)大，甚至整張切片破裂。該問(wèn)題一般由于溫水水溫過(guò)高導(dǎo)致，或者由于組織脂肪較多，脫水不好，脂肪在溫水中更容易散開(kāi)。 （3）刀痕，該問(wèn)題產(chǎn)生一般由于組織內(nèi)含有較硬的成分，如果結(jié)石殘?jiān)}化點(diǎn)，肺粉塵沉積等，或者石蠟中有雜質(zhì)，使切片刀形成缺口，導(dǎo)致鏡下組織出現(xiàn)組織缺損的細(xì)小筆直紋路。 （4）切片不完整，需要診斷的病灶區(qū)域沒(méi)有切出或切面不完整，會(huì)導(dǎo)致診斷困難或者漏診。該問(wèn)的題產(chǎn)生有以下幾點(diǎn)，取材醫(yī)生取材時(shí)，組織切面不平整，技術(shù)員包埋時(shí)組織沒(méi)有按平，如一個(gè)包埋盒里有多個(gè)組織的，這一步顯得尤為重要，切片時(shí)組織蠟塊沒(méi)有修到最大切面，這些方面都會(huì)導(dǎo)致切片不完整。 （5）篩孔與劃痕，鏡下出現(xiàn)很多大小不等的組織空洞，其內(nèi)不見(jiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，邊緣不整齊。該問(wèn)題是由于粗修蠟塊的時(shí)候，修片進(jìn)刀幅度過(guò)大，動(dòng)作過(guò)快，使組織切面粗糙不平，或者出現(xiàn)切面多處發(fā)白，從而造成切片出現(xiàn)大小不一的空洞。 （6）切片厚薄不均或跳片，切片上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的平行的厚薄不等區(qū)域或HE染色后出現(xiàn)明顯的平行分布的深染或者淺染區(qū)。該問(wèn)題產(chǎn)生的原因有以下幾點(diǎn)，切片機(jī)刀架卡位沒(méi)卡緊；刀架變形，導(dǎo)致刀片夾不緊；蠟塊包埋盒表面有多余石蠟，切片機(jī)蠟塊夾頭里有碎蠟，使蠟塊沒(méi)有夾緊；包埋時(shí)加蠟不足或過(guò)程中石蠟漏出，使包埋盒與組織相連不夠緊密，或者形成空心蠟塊；組織本身較硬及切片過(guò)快。 （7）顫痕，鏡下出現(xiàn)比較密集的平行的裂紋，主要出現(xiàn)在胃腸道黏膜腺體、子宮內(nèi)膜、淋巴結(jié)。該問(wèn)題出現(xiàn)主要因?yàn)橄瀴K切片溫度過(guò)低，組織發(fā)脆導(dǎo)致，切片速度過(guò)快，有時(shí)也會(huì)引起。 （8）組織發(fā)白，不能切出完整切片，該問(wèn)題出現(xiàn)主要因?yàn)榻M織脫水不良，脫水良好的組織肉眼應(yīng)該呈半透明狀，如部分呈白色，甚至有水分滲出，說(shuō)明組織脫水不良，沒(méi)有石蠟浸入，缺少石蠟的支撐，難以切片。 （9）蠟塊的水反滲，某些蠟塊在較多水的冰盤(pán)上放置久了，會(huì)出現(xiàn)組織切面向外膨脹，發(fā)白，導(dǎo)致不能切片，該問(wèn)題出現(xiàn)是由于組織脫水不足導(dǎo)致水反滲。 （10）秋冬季靜電大，難以切片，由于秋冬季濕度很低，容易產(chǎn)生靜電，靜電會(huì)使切片難度大增，切片會(huì)相互粘附、鄒縮成團(tuán)，不能展開(kāi)成片。 （11）蠟塊內(nèi)部組織周邊出現(xiàn)或多或少的裂紋，主要因?yàn)槟承┦炠|(zhì)量問(wèn)題，或者冷卻過(guò)快，或者在石蠟沒(méi)完全冷卻的情況下強(qiáng)行把包埋模撬離，都會(huì)使蠟塊內(nèi)部形成裂痕。

1.2.2 HE染色常見(jiàn)問(wèn)題及原因 （1）蘇木精染色過(guò)淡，導(dǎo)致細(xì)胞核染色出現(xiàn)暗淡、蒼白表現(xiàn)。該問(wèn)題主要由使用蘇木精染液中切片停留時(shí)間過(guò)短造成；分化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；或蘇木精存在過(guò)度氧化問(wèn)題，導(dǎo)致染色能力受到影響，不符合使用標(biāo)準(zhǔn)[1]。 （2）細(xì)胞核有紅色或棕色改變情況。該問(wèn)題主要因蘇木精染液有過(guò)度氧化情況出現(xiàn)，或在使用蘇木精染色過(guò)程中切片返藍(lán)不足，或是伊紅染色問(wèn)題導(dǎo)致細(xì)胞核被伊紅覆蓋。 （3）伊紅著色過(guò)淡，該情況主要因伊紅溶液pH值超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)要求，也可因切片過(guò)薄，染色過(guò)程中藍(lán)化液殘留過(guò)度，或因在乙醇脫水環(huán)節(jié)停留過(guò)長(zhǎng)時(shí)間。 （4）顯微鏡觀察中切片有水珠，或肉眼觀察有霧氣，這種情況主要是切片在乙醇處理后未充分進(jìn)行脫水，導(dǎo)致封固后水分無(wú)法排出。 （5）脫蠟后發(fā)現(xiàn)切片有白色斑點(diǎn)，該情況出現(xiàn)的主要原因是烤片環(huán)節(jié)溫度過(guò)低，烤片時(shí)間不足，切片未充分烤干；或二甲苯在切片停留時(shí)間過(guò)短；或二甲苯使用過(guò)久，導(dǎo)致脫蠟不完全[2]。 （6）蘇木精染色過(guò)深，擠占細(xì)胞質(zhì)位置。該類(lèi)問(wèn)題主要受三種情況影響，蘇木精使用過(guò)程中分步驟處理時(shí)間過(guò)短；或切片太厚；或切片在蘇木精染色環(huán)節(jié)停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；或蘇木精pH值過(guò)高，細(xì)胞質(zhì)共染。 （7）切片上有藍(lán)黑沉淀物質(zhì)出現(xiàn)，蘇木精染色環(huán)節(jié)出現(xiàn)金屬膜，附著在切片上。 （8）細(xì)胞質(zhì)過(guò)染情況，由于染色過(guò)程中伊紅溶液濃度過(guò)高；伊紅染色后對(duì)切片進(jìn)行乙醇脫水處理時(shí)間較短；伊紅染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)[3]。 （9）切片位于光鏡時(shí)聚焦困難，封固過(guò)程中封固劑殘留在蓋玻片上。 （10）HE染色不均勻，有斑點(diǎn)或大面積不均勻存在，散布在切片周?chē)绊懠?xì)胞核染色質(zhì)的均勻分布。 （11）切片中出現(xiàn)裸核改變，這是一種有色素樣點(diǎn)狀晶體存在或黑色光滑細(xì)胞核存在情況，主要是因切片在封片前較長(zhǎng)時(shí)間處于空氣當(dāng)中，導(dǎo)致二甲苯發(fā)揮干凈，切片過(guò)于干燥[4]。 （12）細(xì)胞核呈灰藍(lán)狀態(tài)，由于染色過(guò)程中組織溫度過(guò)高；或固定時(shí)間不充分；或石蠟過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的停留；或未充足固定后立即進(jìn)行乙醇脫水處理[5]。

2 討論

本次研究中統(tǒng)計(jì)了石蠟切片及HE染色中常見(jiàn)的23種問(wèn)題，其中每種類(lèi)型出現(xiàn)的頻率不一致，但這23種問(wèn)題對(duì)于臨床診斷都有著直接的影響。而且在現(xiàn)有研究中也充分證明石蠟切片處理以及HE染色中切實(shí)有問(wèn)題存在，尤其是染色環(huán)節(jié)，染色過(guò)深、過(guò)淡、不均勻情況頻繁出現(xiàn)，嚴(yán)重影響最終染色質(zhì)量，并干擾臨床醫(yī)生對(duì)病理的判斷。本次研究中，對(duì)于每種問(wèn)題的解決策略如下。

2.1 石蠟切片問(wèn)題

（1）出現(xiàn)皺褶及折疊，如是組織問(wèn)題，如鈣化灶，有時(shí)難以避免，如是刀片問(wèn)題，則更換新刀位，如是漂片水溫問(wèn)題，則調(diào)節(jié)水溫到適合溫度，漂片時(shí)間適當(dāng)，使切片能完全展開(kāi)，漂片溫度一般比石蠟熔點(diǎn)低10℃左右，但具體溫度要根據(jù)自己科室作出微調(diào)。 （2）如切片散開(kāi)，應(yīng)該及時(shí)調(diào)節(jié)漂片機(jī)水溫，使水溫能夠讓組織展平，又不至于擴(kuò)大或破裂，如是含脂肪組織較多，可以縮短漂片時(shí)間，或者不漂溫水，以保證組織的完整性。 （3）出現(xiàn)較多刀痕時(shí)，應(yīng)該更換新刀位，但對(duì)于某些組織，如鈣化組織、肺淋巴結(jié)組織，難以不出現(xiàn)刀痕，建議在不影響診斷的情況下，可以酌情忽略。 （4）出現(xiàn)切片不完整，必須規(guī)范取材、包埋、修片這幾個(gè)環(huán)節(jié)的操作，醫(yī)生取材盡量使組織塊切面平整，包埋時(shí)把標(biāo)本按平，含有多塊組織的，每塊組織均要按平，粗修時(shí)要觀察蠟塊是否已經(jīng)暴露出最大切面，必要時(shí)要對(duì)蠟塊進(jìn)行重新包埋。 （5）出現(xiàn)篩孔與劃痕，在修片的過(guò)程中應(yīng)把握好進(jìn)刀的幅度，一般在粗修模式下，設(shè)置厚度為5~10 μm，在修片的最后再細(xì)修3~5刀，使蠟塊切面光滑，盡量少出現(xiàn)毛糙及白點(diǎn)。 （6）出現(xiàn)切片厚薄不均或跳片，檢查儀器的卡位是否卡緊，如果是儀器問(wèn)題，如刀架變形、卡位不緊，應(yīng)及時(shí)維修，包埋不牢固或者空心的蠟塊應(yīng)從新包埋，遇到較硬組織時(shí)，可以更換新刀位，稍微降低切片輪轉(zhuǎn)速度，或者讓蠟塊稍微復(fù)溫再切片，對(duì)跳片有比較好的改善，平時(shí)要注意保養(yǎng)切片機(jī)，以免碎蠟碎屑藏積使儀器卡位不緊。 （7）出現(xiàn)顫痕，可以用剛開(kāi)始融化的冰盤(pán)作為蠟塊的冷卻臺(tái)，此時(shí)溫度接近0℃，再降低切片速度，能明顯減少顫痕出現(xiàn)的幾率，如用制冷臺(tái)，應(yīng)調(diào)節(jié)溫度到0℃，但筆者建議用自己制作的冰盤(pán)冷卻，效果更好。 （8）出現(xiàn)組織發(fā)白，應(yīng)該從組織固定、脫水方面進(jìn)行探討，新鮮組織必須在離體后半小時(shí)內(nèi)切開(kāi)固定，固定時(shí)間足夠，小標(biāo)本固定時(shí)間大于8小時(shí)，大標(biāo)切開(kāi)本固定時(shí)間大于16小時(shí)，取材標(biāo)本體積不能超過(guò)2 cm×1.5 cm×0.3 cm，脫水程序要摸索出適合自己科室的條件。 （9）蠟塊的水反滲，蠟塊不能在水較多的冰面上過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，可以在切片前3~5分鐘再放到冰面進(jìn)行冷卻，基本可以避免該情況發(fā)生。 （10）秋冬季靜電大，難以切片，此時(shí)可以增加室內(nèi)濕度，購(gòu)買(mǎi)專(zhuān)用的切片加濕器，或者改裝家用加濕器，加裝管道，引管到蠟塊夾頭旁，調(diào)節(jié)霧氣的大小，使蠟塊輕微濕潤(rùn)，即可除去靜電影響，或者在冰面加水，使冰面濕潤(rùn)，也可減少靜電影響，但切片時(shí)注意不能修片太多，一般前3~5張切片效果好，往后的切片會(huì)逐漸出現(xiàn)皺縮成團(tuán)的現(xiàn)象。 （11）蠟塊內(nèi)部組織周邊出現(xiàn)裂紋，如是石蠟質(zhì)量問(wèn)題，應(yīng)該更換批次或者更換牌子，剛包埋好的蠟塊，石蠟仍是液態(tài)，應(yīng)平放在冷卻臺(tái)上自然冷卻，不應(yīng)快速置于冰水當(dāng)中，待完全凝固后再分離包埋模，可明顯減少裂紋出現(xiàn)。

2.2 HE染色問(wèn)題

（1）現(xiàn)蘇木精染色過(guò)淡問(wèn)題，應(yīng)重新進(jìn)行切片染色，延長(zhǎng)蘇木素浸泡時(shí)間，縮短分化時(shí)間，也可在染蘇木素前把片浸泡在1.5%醋酸溶液中，調(diào)節(jié)切片的pH值，使蘇木素對(duì)細(xì)胞核染色的針對(duì)性增強(qiáng)，同時(shí)可以降低細(xì)胞質(zhì)的共染，其中1.5%冰醋酸也可以作為蘇木素中冰醋酸的補(bǔ)充，可穩(wěn)定蘇木素的pH值，延長(zhǎng)蘇木素的使用壽命。 （2）出現(xiàn)細(xì)胞核有紅色或棕色改變時(shí)，需要在染色前檢查蘇木精的質(zhì)量情況，如果存在過(guò)度氧化以及變質(zhì)等問(wèn)題，及時(shí)進(jìn)行更換，染色過(guò)程中必須經(jīng)過(guò)返藍(lán)液浸泡，保障藍(lán)化時(shí)間充足。 （3）對(duì)于伊紅著色過(guò)淡問(wèn)題，染色前測(cè)試伊紅溶液的pH值，伊紅溶液pH值必須低于5，盡量控制在4.6~5.0之間，以便保障染色效果。但水溶性伊紅pH值容易受外界影響，如醋酸的揮發(fā)，殘余自來(lái)水的混入等，均會(huì)使伊紅的pH升高，影響著色效果，可以更換為0.2%的醋酸化伊紅醇溶液[6]，在染伊紅前先浸泡95%乙醇，同時(shí)，需要切片充分藍(lán)化后，徹底清潔其中的弱堿性溶液后再進(jìn)行下一步操作；測(cè)量切片厚度是否太薄，避免乙醇脫水時(shí)間過(guò)長(zhǎng)稀釋其中顏色[7]。 （4）對(duì)于顯微鏡下觀察切片有水珠情況，發(fā)現(xiàn)后將蓋玻片拿掉，溶解封固劑，可在無(wú)水乙醇前添加一缸苯酚+TO/二甲苯溶液，取出殘余水份，并連續(xù)將切片放置在新鮮無(wú)水乙醇中，脫水完成后進(jìn)行再次封固。 （5）對(duì)于切片脫蠟后出現(xiàn)白色斑點(diǎn)問(wèn)題，必須保障充分烘烤，除去切片中的水分；對(duì)于烘烤時(shí)間過(guò)長(zhǎng)問(wèn)題，切片可能出現(xiàn)脫落，后續(xù)處理無(wú)法補(bǔ)救；二甲苯脫蠟時(shí)間要充足，如出現(xiàn)脫蠟不完全，可以延長(zhǎng)時(shí)間或加溫，還需要定期更換脫蠟二甲苯，一般500 mL二甲苯處理500以?xún)?nèi)張切片為宜，此外，如果因二甲苯時(shí)間過(guò)長(zhǎng)短導(dǎo)致斑點(diǎn)，可通過(guò)脫色、漂白重新進(jìn)行脫蠟染色[8]。 （6）對(duì)于蘇木精染色過(guò)深問(wèn)題，如果因切片過(guò)厚導(dǎo)致，可重新進(jìn)行切片；但并非切片過(guò)厚造成，則需要重新進(jìn)行染色，縮短蘇木素染色或者延長(zhǎng)分化時(shí)間。 （7）對(duì)于切片上有藍(lán)黑沉淀物質(zhì)問(wèn)題，需要在每次染色前認(rèn)真檢查與過(guò)濾蘇木精，盡量使用處于半氧化狀態(tài)的蘇木精，避免產(chǎn)生金屬膜。 （8）對(duì)于細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)分化不足或過(guò)染問(wèn)題，可通過(guò)縮短伊紅染色時(shí)間，或者延長(zhǎng)伊紅后脫色乙醇的時(shí)間；若因切片過(guò)厚，則需要調(diào)整切片厚度[9]。 （9）對(duì)于切片位于光鏡時(shí)聚焦困難問(wèn)題，需要移出蓋玻片，使用新的蓋玻片進(jìn)行重新密封，并嚴(yán)格檢查切片密封效果，如果為密封方法問(wèn)題，需要及時(shí)進(jìn)行調(diào)整。 （10）對(duì)于HE染色不均勻問(wèn)題，細(xì)胞核染色不均多為固定不足引起，如外層細(xì)胞核染色正常，內(nèi)層細(xì)胞核染色偏淺或灰染，應(yīng)規(guī)范組織固定流程，使組織固定充分，細(xì)胞質(zhì)染色不均，多數(shù)由于伊紅分化時(shí)沒(méi)有充分抖動(dòng)，造成脫色不均引起，改成醇溶性伊紅的染色程序，能有效的減少細(xì)胞漿染色不均的情況[10]。 （11）對(duì)于切片中出現(xiàn)裸核改變問(wèn)題，先拿掉蓋玻片，溶解封固劑，重新進(jìn)入到脫水環(huán)節(jié)、封固環(huán)節(jié)，使切片處于濕潤(rùn)狀態(tài)，避免其過(guò)于干燥問(wèn)題[11]。 （12）對(duì)于細(xì)胞核呈灰藍(lán)狀態(tài)問(wèn)題，從理論層面來(lái)講，這種情況主要是因組織與石蠟沒(méi)有充分接觸，或在溫度較高蠟液中停留較長(zhǎng)時(shí)間，其中對(duì)于第一種情況，需要將組織用塑料包埋盒包裝放置在冷空氣內(nèi)進(jìn)行冷凝，冷凝后重新加熱，融化石蠟；而第二種情況需要在組織固定良好情況下，重新進(jìn)行脫水處理[12]。

綜上所述，石蠟切片與HE染色作為臨床病理檢驗(yàn)不可缺少的技術(shù)手段之一，對(duì)于病理檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量的影響關(guān)系到臨床診斷的科學(xué)性以及準(zhǔn)確性，因此，面對(duì)當(dāng)前石蠟切片處理以及HE染色問(wèn)題頻出的情況，本文對(duì)常見(jiàn)的問(wèn)題進(jìn)行了系統(tǒng)的總結(jié)，并針對(duì)每種問(wèn)題出現(xiàn)的原因進(jìn)行了解決對(duì)策分析，希望該問(wèn)題能夠引起醫(yī)院以及臨床的重視，在臨床實(shí)踐當(dāng)中不斷補(bǔ)充，總結(jié)豐富經(jīng)驗(yàn)，科學(xué)應(yīng)對(duì)石蠟切片處理以及HE染色中出現(xiàn)的突發(fā)情況，從而有效提升病理檢驗(yàn)準(zhǔn)確性[13]。