基于生物信息學從體質轉化角度探討 濕性體質的關鍵基因與通路

周宵 魏彬彬 唐標

〔摘要〕 目的 通過生物信息數據挖掘，從體質轉化角度進行差異分析，探討濕性體質關鍵的生物學機制。方法 通過高通量基因表達數據庫（gene expression omnibus data base， GEO）下載芯片“GSE140769”，將平和體質轉變為濕性體質的前后血清高通量蛋白測序的結果進行篩選，獲得12個顯著差異蛋白;將濕性體質轉變為平和體質前后的血清高通量蛋白測序的結果進行差異分析，得到14個顯著差異蛋白，將其與平和體質轉變為濕性體質的12個顯著差異蛋白進行交叉比對，得到4個介導平和體質與濕性體質的關鍵差異蛋白。利用R語言、KOBAS 3.0、DAVID 6.8等生物信息分析工具對其進行注釋分析。結果 平和體質轉變為濕性體質的顯著差異蛋白GO分析顯示，主要參與了細胞質應激顆粒等細胞組成、神經體細胞調節等生物過程、受體配體活性等分子功能;通路分析顯示，主要與淋巴細胞和非淋巴細胞介導的免疫相互作用以及MSP/RON信號通路有關;疾病分析主要與潰瘍性結腸炎、慢性阻塞性肺疾病等相關。平和體質與濕性體質的4個關鍵差異蛋白（MSP、DPPII、Siglec-7、TREML1），分別在平和體質中下調，濕性體質中上調，進一步分析發現該4個蛋白主要介導了細胞的免疫應答與炎癥反應，以及MSP/RON信號通路。結論 MSP、DPPII、Siglec-7、TREML1介導的免疫應答與炎癥反應，以及MSP/RON信號通路可能是介導平和體質與濕性體質差異關鍵的生物學基礎。

〔關鍵詞〕 濕性體質;差異表達蛋白;關鍵蛋白;平和體質;生物學基礎

〔中圖分類號〕R211? ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.06.011

The Key Genes and Pathways of Dampness Constitution from the Perspective of Constitution Transformation Based on Bioinformatics

ZHOU Xiao， WEI Bingbing， TANG Biao*

（Medical School， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕? Objective To explore the key biological mechanism of dampness constitution （DC） from the perspective of physique conversion by mining biological information data and analyzing the difference. Methods Chip “GSE140769” was downloaded through gene expression omnibus data base （GEO）. The results of high-throughput protein sequencing before and after the transformation from balanced constitution （BC） to DC were screened， and 12 significant difference proteins were obtained; through the difference analysis of serum high-throughput protein sequencing results before and after the transformation from DC to BC， 14 significant difference proteins were obtained， which were cross compared with 12 significant difference proteins before and after the transformation from BC to DC， and 4 key difference proteins were obtained. R language， KOBAS 3.0， DAVID 6.8 and other bioinformatics analysis tools were used for annotation analysis. Results GO analysis of the significant difference proteins in the transformation from BC to DC showed that it was mainly involved in cell composition such as cytoplasmic stress particles， biological processes such as neural somatic cell regulation， and molecular functions such as receptor ligand activity; KEGG pathway analysis showed that it is mainly related to immune regulatory interactions between a lymphoid and a non-lymphoid cell and MSP/RON signaling pathway; disease analysis is mainly related to ulcerative colitis and chronic obstructive pulmonary disease. The four key differential proteins （MSP， DPPII， Siglec-7， TREML1） between BC and DC were down-regulated in BC and up-regulated in DC， and further analysis founded that the four proteins mainly mediate the cellular immune response and inflammation， and MSP/RON signaling pathway. Conclusion MSP， DPPII， Siglec-7， TREML1 mediated immune response and inflammation， and MSP/RON signaling pathway may be the key biological basis for the difference between BC and DC.

〔Keywords〕 differentially expressed proteins; key proteins; constitution; biological basis

體質稟承于先天，得養于后天，其形成因素是復雜的，個體體質并不是一成不變，而是相對穩定性和動態可變性的統一。體質在很大程度上由遺傳決定，并且受到后天因素影響導致體內蛋白質的動態變化，監測體質蛋白動態變化，從蛋白水平去研究體質，對體質的診斷以及體質預測更有可行性[1]。

目前，認為體質類型在代謝、功能及結構都具有相應的生物學物質基礎[2]，而生物信息學是探索體質相關生物學基礎的有效手段[3]。關于體質學的生物學基礎研究大多從基因切入，而隨著研究的深入發現基因組學存在著一定的局限性[4]。蛋白在通過辨識體質來預測易患疾病具有較大意義，但目前其相關研究較少，本文采用數據挖掘方法初次從體質轉化的角度通過蛋白組學對濕性體質（痰濕體質或濕熱體質）的相關的生物學基礎進行了研究。

1 資料與方法

1.1? 芯片信息

通過高通量基因表達數據庫（gene expression omnibus data base， GEO;https：//www.nc bi.nlm.nih.gov /geo/），進行條件檢索：輸入“dampness constitution”，將篩選條件限定為“homo sapiens”，確定適合本研究的芯片。

芯片選用標準：（1）測序血清來源于體質轉變前后的血清，并將體質轉變前后的血清蛋白譜進行差異分析，而非傳統的平和體質患者與濕性體質患者不同個體組成的平和體質組或者濕性體質組進行組間血清差異蛋白分析;（2）僅為蛋白高通量測序芯片;（3）芯片平臺包括蛋白類型和蛋白ID信息。

芯片樣本信息：第一組包括4個平和體質個體轉化為濕性體質前后血清蛋白表達譜，以及3個濕性體質個體轉化為平和體質前后血清蛋白表達譜。第二組包含38個濕性體質個體血清蛋白表達譜和37個平和體質個體血清蛋白表達譜。其中，4個平和體質個體轉變為濕性體質包括男2例、女2例，年齡（44.75±16.58）歲，體質量指數（25.36±3.45）;3個濕性體質個體轉變為平和體質包括男2例、女1例，年齡（56.00±27.84）歲，體質量指數（23.03±1.15）。

1.2? 差異表達蛋白的分析與確定

GEO2R是GEO數據庫提供的一個基于R語言的在線分析程序[5]。利用GEO2R分析“1.1”所獲得的芯片“GSE140769”，將平和體質轉變為濕性體質的前后血清蛋白表達譜（n=4）進行GEO2R在線分析，獲取前250個差異蛋白信息;另外將濕性體質轉變為平和體質的前后血清蛋白表達譜（n=3）進行GEO2R在線分析，獲取前250個差異蛋白信息，根據篩選條件：P<0.05且|logFC|（fold charge， FC）>1，即差異倍數大于>2，該絕對值越大，差異表達越明顯，正負分別代表上調與下調。

1.3? 平和體質轉變為濕性體質的顯著差異蛋白GO功能分析

通過R語言中“clusterProfiler”包[6]對平和體質轉變為濕性體質的顯著差異蛋白進行基因本體（gene ontology， GO）分析，對這些差異蛋白介導的細胞組成（cellular component， CC），分子功能（mole?

cular function， MF），生物過程（biological process， BP）進行注釋，以P<0.05為差異具有統計學意義。

1.4? 平和體質轉變為濕性體質的顯著差異蛋白KEGG信號通路以及相關疾病富集分析

KOBAS是常用的通路與疾病富集分析的生物信息在線分析工具[7]。采用KOBAS 3.0（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3）在線工具對平和體質轉變為濕性體質的顯著差異蛋白進行基因通路富集分析以及疾病富集分析。

1.5? 體質關鍵差異蛋白的確定以及GO功能注釋

利用韋恩圖在線工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）分別將平和體質轉變為濕性體質的顯著差異蛋白與濕性體質轉變為平和體質的顯著差異蛋白進行交叉比對，獲得介導濕性體質與平和體質關鍵差異的蛋白。

利用David 6.8在線分析平臺（https：//david.ncifcrf.gov/）的Function Annotation模塊，輸入所獲得的關鍵蛋白Uniprot ID，通過基因轉換工具獲得David 6.8可識別的ID從而進行GO功能注釋，對體質關鍵蛋白介導的細胞組成、生物過程、分子功能進行相應的注釋。

2 結果

2.1? 芯片信息

根據“1.1”的芯片選入標準，篩選出符合要求的高通量抗體微陣列數據集合，即“GSE140769”。“GSE140769”屬于GPL27785平臺，本研究選取了第一組樣本數據包括4個平和體質個體轉變為濕性體質，3個濕性體質個體轉變為平和體質，分別保留其體質轉變前后的血清，通過半定量蛋白質組學陣列（GSH-CAAX00， RayBiotech， Inc.， Peachtree Corners， GA，美國）測量1 000種獨特人類蛋白質的抗體。芯片樣本中濕性體質是痰濕體質與濕熱體質的集合，體質的分類符合《中醫體質分類與確定》標準[8]。

2.2? 平和體質轉變為濕性體質的顯著差異蛋白以及GO功能分析

將4個平和體質（前）與濕性體質（后）血清蛋白進行GEO2R在線分析，logFC為濕性體質（后）/平和體質（前），根據方法中的篩選條件，得到表1。如表1所示：平和體質轉變為濕性體質后，獲得12個顯著差異蛋白。其中，巨噬細胞刺激蛋白（macrophage

stimulating protein， MSP）、二肽基肽酶Ⅱ（dipeptidyl peptidase Ⅱ， DPP-Ⅱ）、唾液酸結合性免疫球蛋白樣凝集素7（sialic acid-binding ig-like lectin 7， Siglec-7）、髓樣細胞觸發受體1（triggering receptors expressed on myeloid cells-l， TREML-1）等蛋白上調，Nestin、TAFA2、IGSF3等下調。

為了進一步探討平和體質（前）與濕性體質（后）的顯著差異蛋白介導的生物功能，對其進行GO分析。結果顯示：細胞組成主要參與細胞質應激顆粒、多核糖體組成;分子功能以受體配體活性、絲氨酸肽酶活性為主;另外在生物過程中主要參與神經體細胞調節、干細胞增殖等。見圖1。

2.3? 平和體質轉變為濕性體質的顯著差異蛋白信號通路與疾病分析

平和體質（前）與濕性體質（后）的顯著差異蛋白KEGG信號通路以及疾病分析如圖2-3所示，其中信號通路中聯系最為密切的分別是淋巴細胞與非淋巴細胞之間的免疫信號通路以及MSP/RON信號通路，疾病富集分析顯示其與潰瘍性結腸炎以及慢性阻塞性肺疾病等疾病密切相關。

2.4? 濕性體質轉變為平和體質的顯著差異蛋白

同理將3個濕性體質（前）轉變為平和體質（后）血清樣本通過高通量抗體微陣列的分析結果，篩選要求同方法，得到14個平和體質的顯著差異蛋白，可觀察到在平和體質中GSTM1、HAO-1、Fgr等蛋白顯著上升;而MSP、DPPII、Siglec-7等蛋白表達顯著下降。見表2。

2.5? 濕性體質與平和體質的關鍵差異蛋白

將平和體質（前）與濕性體質（后）的12個顯著差異蛋白與濕性體質（前）與平和體質（后）的14個顯著差異蛋白，通過韋恩圖進行交叉比對，得到4個關鍵蛋白分別是MSP、DPPII、Siglec-7、TREML1，且這4個蛋白在平和體質轉變為濕性體質后中顯著上調，而在濕性體質轉變為平和體質后中顯著下調。見表3。

2.6? 濕性體質與平和體質關鍵差異蛋白的GO功能注釋分析

進一步GO功能注釋顯示MSP、DPPII、Siglec-7、TREML1參與的生物過程主要有炎癥反應與細胞免疫應答反應，細胞組成主要是質膜、細胞外體等，介導的分子功能主要參與酪氨酸激酶受體活性激活、糖結合以及相關的受體活性，通路分析顯示主要涉及到MSP/RON信號通路。見表4。

3 討論

體質的轉化體現了“體質的可調”，調控體質對于中醫“治未病”有著重要意義[9]，而目前鮮有關于體質轉化的報道。不同于以往的組間差異分析，本文選取了相關體質轉化前后的血清高通量抗體微陣列數據，獲得了4個平和體質轉變為濕性體質（痰濕體質或濕熱體質）后的12個顯著差異表達蛋白以及3個濕性體質轉變為平和體質后的14個顯著差異表達蛋白，另外通過交叉對比獲得介導濕性體質與平和體質差異的關鍵蛋白，從蛋白水平對濕性體質分子生物學特征進行初步探索。

平和體質轉變為濕性體質的顯著差異蛋白GO分析與信號通路分析顯示差異蛋白主要與淋巴、非淋巴細胞介導的免疫相互作用密切相關，這與目前關于濕性體質的生物學研究結果一致[10-11]。其次是MSP/RON信號通路，MSP/RON信號傳導通路在炎癥以及代謝中都發揮重要的作用[12]。MSP/RON通路的異常會促進腸道炎癥的發生，增加了克羅恩病的發病風險[13]。而濕性體質是克羅恩病的易患體質類型[14-15]，進一步提示MSP/RON信號通路可能是濕性體質關鍵的信號通路。另外，在代謝方面，MSP/RON信號通路介導的生理功能可以抑制肝臟的脂質代謝以及糖異生，其在肝脂質和葡萄糖代謝中具有潛在的有益作用，提示MSP可以作為維持代謝穩態的關鍵調節劑，為代謝綜合征提供新的治療靶點[16]。這為濕性體質在治療代謝性疾病，實現精準個體化醫療提供了一個新的治療方向，也為今后的調體干預藥物的研發提供了新的靶點。

平和體質轉變為濕性體質的顯著差異蛋白疾病分析顯示與多種疾病密切相關，其中以潰瘍性結腸炎最為密切。朱微微等[17]關于不同中醫體質類型與潰瘍性結腸炎的Logistic回歸分析結果表明痰濕質、濕熱質與潰瘍性結腸炎的患病率密切相關，痰濕質、濕熱質是導致潰瘍性結腸炎的主要危險因素。這與本文濕性體質顯著差異蛋白疾病分析結果一致，進一步驗證了濕性體質顯著差異蛋白疾病富集分析結果的可靠性，為痰濕質、濕熱質是潰瘍性結腸炎的高發體質提供了一個新的生物學證據。除此之外，與該12個差異蛋白疾病富集相關的慢性阻塞性肺疾病[18]、支氣管哮喘[19-20]、周圍神經疾病[21]等疾病均在目前已有的關于濕性體質（痰濕質與濕熱質）研究中得到了驗證。另外，在對濕性體質轉變為平和體質的14個顯著差異蛋白進行疾病富集分析時發現其與濕性體質的相關疾病（如潰瘍性結腸炎、慢性阻塞性肺疾病等）沒有相關性，因此，從生物信息的角度證明，通過調體干預改善體質可以減少其相關疾病的發生與復發，達到中醫未病養生，防病于先的“治未病”的目的[22]。

值得一提的是，MSP、DPP-Ⅱ、Siglec-7、TREML-1分別在平和體質轉變為濕性體質的顯著差異蛋白中上調，而在濕性體質轉變為平和體質的顯著差異蛋白中下調，據此我們推測該4個蛋白所介導的生理功能可能是導致平和體質與濕性體質差異的重要組成部分。另外，GO功能注釋顯示該4個蛋白介導的生理功能主要與炎癥反應以及免疫應答反應相關，通路分析顯示主要與MSP/RON信號通路相關，這與平和體質轉變為濕性體質顯著差異蛋白研究結果一致，進一步提示MSP、DPPII、Siglec-7、TREML1介導的免疫應答與炎癥反應，以及MSP/RON信號通路可能是濕性體質關鍵的生物學機制。

目前，中醫的體質分型標準百家爭鳴，雖有中醫體質量表與《中醫體質分類與判定》標準，但量化的指標不明確，可能會造成主觀上的偏差[23-24]。而MSP、DPP-Ⅱ、Siglec-7、TREML-1可能是介導濕性體質與平和體質差異的關鍵蛋白，這為目前體質分型普遍存在的量化指標不明確提供了一個很好的解決思路，但其是否能成為濕性體質與平和體質分類的量化指標，有待進一步驗證。

蛋白研究體質能夠對體質要素進行更好地反映，蛋白的動態表達能較好地反映體質的可變性和可調性[25]，本文首次從體質轉化的角度進行差異分析，通過平和體質轉變為濕性體質顯著差異蛋白進一步證明濕性體質存在罹患潰瘍性結腸炎、克羅恩病、慢性阻塞性肺疾病高風險，而調體干預轉化體質可以達到中醫“治未病”的目的，預防疾病的發生發展。MSP、DPP-Ⅱ、Siglec-7、TREML-1體質關鍵差異蛋白介導的炎癥反應、免疫應答反應、MSP/RON信號通路可能是濕性體質與平和體質差異的關鍵的生物學基礎。

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