黃瓜TRM基因家族鑒定及分析

李豪,虎亞靜,張清霞,王麗娜,任仲海

黃瓜基因家族鑒定及分析

李豪,虎亞靜,張清霞,王麗娜*,任仲海*

山東農業大學園藝科學與工程學院, 山東 泰安 271018

黃瓜是我國極為重要的一種經濟作物，而果實大小是黃瓜最重要的性狀之一。是已被定位到的控制黃瓜果形的少數基因之一，但是目前研究者對黃瓜中TRM (TONNEAU1 Recruiting Motif)家族的認識還比較少。本研究通過生物信息學技術對黃瓜TRM家族基因進行分析，從氨基酸序列的相似性、不同物種TRM的進化關系、結構域、亞細胞定位等方面進行了比較。黃瓜TRM家族共有28個成員，主要分布在1、2、3、5四條染色體上，都有細胞核定位信號。通過等電點分析我們發現，黃瓜中TRM一半偏酸性，一半偏堿性。表達特異性分析表明，大部分TRM在果實中的表達量較高，這說明TRM可能對于果實的生長發育有重要作用。

黃瓜;基因; 生物信息學分析

黃瓜是我國廣泛種植的一種蔬菜作物，果實是黃瓜最重要的商品器官。果實形狀是影響黃瓜品質的重要因素之一。黃瓜的果形主要由果實長度、果實橫徑、果形指數等決定，這些因素影響著果實的外觀品質和市場等級劃分[1]。黃瓜的果實形狀由多基因控制。2017年，Pan等在1號染色體上定位到第一個控制黃瓜果實形狀的基因[2]。2018年，Wu等在二號染色體上定位到，一個黃瓜果實長度的正調控基因，它是番茄中控制番茄果實形狀的基因的同源基因[3]。通過調控乙烯的生物合成來調控細胞分裂，從而調控黃瓜果實形狀[4]。Zhao等于2019年鑒定到一個負調控黃瓜果實形狀的基因CsFUL1，CsFUL1通過調控的表達來調控細胞分裂和膨大，從而影響果實的形狀[5]。2020年Zhang等研究發現，通過影響細胞分裂素和多胺的生物合成和代謝來控制果實細胞的增殖，從而調控果實形狀[6]。

TRM家族基因對于植物的生長發育起著重要的作用，其在多種植物中都行使重要功能。在擬南芥中有34個TRM，它們有6個保守基序，其中一個是TON1結合基序。AtTRM1能夠與微管蛋白結合，并且可以通過與TON1的互作將其靶向于微管蛋白[7]。TRM5是TRM家族的一個重要成員，有研究表明，()對擬南芥的生長發育起著重要作用，突變體具有明顯的發育缺陷表型：葉片生長變慢、花發育遲緩、根變短等[8]。而在番茄中SlTRM5可以與OVTE共同調控番茄果實的形狀。另外Tang等的研究將擬南芥中突變掉后會導致胚胎致死和種子敗育[9]。

在番茄中有26個，關于番茄中的研究還很少，是唯一一個被研究的家族成員。Wu等的研究表明，在番茄中SlTRM與OVTE在果實發育過程中通過調節細胞的分裂從而共同調控果實形狀[3]。但是目前關于黃瓜家族的研究還未見報道。

本文鑒定了黃瓜家族成員，其在染色體上的分布，與番茄和擬南芥中TRM的親緣關系，黃瓜的基因結構，以及其在不同組織的表達量。這為后面深入研究黃瓜TRM的功能提供了一些參考。

1 材料與方法

1.1 黃瓜TRM家族基因的鑒定

擬南芥基因下載于擬南芥基因組網站(https://www.Arabidopsis.org/)，番茄基因的蛋白序列下載于番茄基因組網站(https://solgenomics.net)，并以擬南芥和番茄TRM的蛋白序列作為查詢序列，在黃瓜基因組網站(http://cucurbitgenomics.org/)上進行Blast，檢索并輸出最優的比對結果，確定黃瓜家族成員的候選基因，并根據其在染色體上的位置進行命名。

黃瓜家族基因成員蛋白質的相對分子量(Mw)、氨基酸數量(AA)和等電點(pI)使用ExPasy計算(https://web.ExPasy.org/compute_pI/)。使用在線軟件預測黃瓜TRM亞細胞定位Plant-mPLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)。

1.2 黃瓜、番茄、擬南芥TRM進化關系分析

本文使用軟件MEGA7分析黃瓜、擬南芥和番茄三個物種中的系統發育關系。首先通過Clustal X對所有TRM的蛋白序列進行對比，隨后通過鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統進化樹，并用Bootstrap法（重復次數設定為1000）評估系統進化樹。最后利用Evolview (https://www.omicsclass.com/article/671)在線網站對進化樹進行可視化和修飾。

1.3 黃瓜TRM染色體定位分析

本文從黃瓜基因組網站(http://cucurbitgenomics.org/)獲得黃瓜的物理位置，然后采用Map Inspect繪圖工具繪制其基因連鎖圖譜。

1.4 黃瓜TRM基因及蛋白結構的鑒定

黃瓜家族基因的內含子和外顯子信息從黃瓜基因組數據庫分析得到，基因的結構通過GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線生成[10,11]；使用MEME (https://www.omicsclass.com/article/432)在線網站，對黃瓜家族的保守motif基序進行分析，最后用TBtools[12]可視化。

1.5 黃瓜TRM基因組織表達特異性分析

基于已發表的RNA-seq數據(SRA046916)分析了在各個組織中的表達模式[13]，包括根、莖、葉、雌花、雄花、子房、未受精子房、已受精子房和卷須等九個組織[14]。基于FPKM值，使用TBtools軟件[12]來可視化基因的表達譜。

2 結果與分析

2.1 黃瓜TRM家族基因的鑒定

本研究以34個擬南芥基因以及26個番茄基因的蛋白序列作為查詢序列，在黃瓜基因組網站進行Blast，輸出比對結果，最終鑒定到了28個黃瓜成員，并對其進行命名（表1）。通過比較分析發現，它們的內外顯子數目并不一致，最少的只有兩個外顯子（，，），最多的有7個外顯子（）。其基因長度也是相差甚大，最短的基因為1154bp（），最長的基因為5797bp（），其蛋白質大小差異也很明顯，最小的為39351.26 kD（），而最大的為117734.58kD（）。等電點方面，有15個成員偏酸性（，，，，，，，，，，，，，，），13個成員偏堿性（，，，，，，，，，，，，）。通過在線工具Plant-mPLoc預測黃瓜的亞細胞定位可知，所有的家族成員都有細胞核定位信號。

表 1 黃瓜TRM基因家族信息

2.2 黃瓜、番茄、擬南芥TRM進化關系分析

我們利用MEDGA7軟件分析了34個擬南芥，26個番茄和28個黃瓜的親緣關系（圖1）。通過分析我們發現根據親緣關系的遠近我們可以將88個分為5個組。第一組包括9個擬南芥（，，，，，，，，），3個番茄（，，），4個黃瓜（，，，）。第二個組包括6個擬南芥（，，，，，），3個番茄（，，），6個黃瓜（，，，，，）。第三個組包括5個擬南芥（，，，，），3個番茄（，，），4個黃瓜（，，，）。第四個組包括7個擬南芥（，，，，，，），6個番茄（，，，，，，，，，），7個黃瓜（，，，，，，）。第五個組包括8個擬南芥（，，，，，，，），11個番茄（，，，，，，，，，，），9個黃瓜（，，，，，，，，）。

圖1 擬南芥TRM、番茄TRM、黃瓜TRM進化關系分析

2.3 黃瓜TRM在染色體上的分布

本文使用Map Inspect分析了28個黃瓜在染色體上的位置（圖2），28個基因中有10個位于3染色體上（，，，，，，，，，），5個位于5號染色體上（，，，，），4個位于1號染色體上（，，，），3個位于2號染色體上（，，），3個位于6號染色體上（，，），1個位于7號染色體上（）。

圖2 黃瓜染色體定位

Fig.2 Chromosome location

2.4 黃瓜TRM基因結構的分析

本研究通過在線工具GSDS分析了黃瓜的基因結構（圖3），28個黃瓜中外顯子數目在2到7個之間。28個基因中有兩個外顯子的基因有3個（，，），有3個外顯子的基因有5個（，，，，），有4個外顯子的基因有6個（，，，，，），有5個外顯子的基因有11個（，，，，，，，，，，，），有6個外顯子的基因有2個（，），有7個外顯子的基因有1個（）。另外我們還通過在線工具MEME分析了28個的保守motif基序，通過分析發現黃瓜中含有8個保守基序（M1，M2，M3，M4，M5，M6，M7，M8），其中M6基序的保守性最差，只有四個成員含有M6基序，而M2基序的保守性最強，所有的28個成員中都含有M2基序。另外8個基序中比較保守的基序還有M1、M3、M4、M5，分別有19、14、15、14個成員含有上述基序。目前關于這些據序功能的研究還比較少，Tang等發現在人類CPF350蛋白中存在中的M2基序，CPF350能夠通過M2基序與FOP蛋白互作[9]。

圖3 黃瓜TRM基因結構分析

2.5 黃瓜TRM基因表達特異性的分析

本研究通過已發表的轉錄組數據（SRA046916）分析了黃瓜在根、莖、葉、雌花、雄花、子房、未受精子房、已受精子房和卷須等九個組織中的表達量情況，并通過TBtools軟件做出了可視化的熱圖（圖4）。通過分析我們發現，大部分在子房、未受精子房和已受精子房中表達量較高，少數基因在雌花和雄花中表達量較高，極少數基因在根，莖和卷須中表達量較高。因此黃瓜中的很有可能與黃瓜的生殖生長以及黃瓜果實的發育相關。

圖4 黃瓜TRM基因在不同組織中的表達量分析

注：FF: 雌花; MF: 雄花; O: 子房; EOF: ex-o-fer, 受精子房; EO: ex-o-unfer, 未受精子房; L: 葉; S: 莖; T: 卷須R: 根。

Note: FF: Female flower; MF: Male flower; O: Ovary; EOF: ex-o-fer, Expanded ovary (fertilized); EO: ex-o-unfer, Expanded ovary (unfertilized); L: Leaf; S: Stem; T: tendril R: Root.

3 討論

果實是黃瓜最重要的商品器官，果實的形狀是影響黃瓜商品價值的重要因素之一。目前已經定位到數個控制黃瓜果實形狀的基因，其中為其中之一。屬于黃瓜家族的一個成員，但是目前還沒有關于黃瓜家族系統全面的研究。本文首次鑒定到了黃瓜中的28個成員，并對其基因結構和蛋白質結構進行了分析，通過分析我們發現成員所包含外顯子數目是相近的，就蛋白質結構方面，大部分成員所包含的motif基序也是相似的，某些重要的基序在中具有高度的保守性，比如M2基序。

近年來隨著黃瓜基因組學的發展，讓我們可以越來越方便的解析黃瓜中某些特定基因的功能[15]。本文基于已發表的RNA-seq數據(SRA046916)分析了在各個組織中的表達模式[13]，經過我們的分析發現，黃瓜的28個家族成員中有23個基因在果實或雌花、雄花中高表達。這說明在黃瓜中很可能會影響黃瓜果實的發育，這與番茄中對的研究是一致的。在番茄中與互作，通過調控細胞的分裂來調節番茄果實的形狀，是在番茄中的同源基因，而位于一個控制黃瓜果實形狀的QTL中[3]。而根據Wang等的研究是一個調控黃瓜果實形狀的主效QTL，它可以控制開花當天的果實長度、果實直徑、果形指數，商品瓜時期的果實長度、果實直徑、果形指數，以及成熟瓜時期的果實長度、果實直徑、果形指數[16]。根據Pan等的研究結果我們知道，1、2、3號染色體上存在大量控制黃瓜果實形狀的QTL，而黃瓜家族有68%的成員位于這三條染色體上，這也可能從側面說明，可能有多個成員參與黃瓜果實發育的調控。

4 結論

家族是一個調控植物生長發育的重要家族，本文利用生物信息學技術對家族進行了分析。在黃瓜中存在28個，主要分布在1、2、3、5四條染色體上，通過表達特異性特異性分析發現，多數黃瓜在果實發育相關組織特異性表達。通過本研究我們發現參與調控黃瓜果實的發育。

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Identification and Analysis onFamily in Cucumber

LI Hao, HU Ya-jing, ZHANG Qing-xia, WANG Li-na*, REN Zhong-hai*

271018,

Cucumber is an extremely important economic crop in our country, fruit size is one of the most important traits of cucumber.is one of the few isolated genes which control cucumber fruit shape. However, little is known about the information of TRM (TONNEAU1 Recruiting Motif) family in cucumber. In this study, we used bioinformatics technology to study the cucumber TRM family genes. We compared and analyzed the similarity of amino acid sequence, evolutionary relationship of TRM among different species, functional domains and subcellular location. We found that there are 28 members in the cucumber TRM family, which are mainly distributed on the four chromosomes (1, 2, 3, and 5), and they all have the nucleus-localized signal. By isoelectric point analysis, we found that the half TRMs in cucumber are acidic and the other half are alkaline. Gene expression analysis in different tissues showed that most ofdisplay higher expression in fruit, which indicates thatmay play important roles in the process of fruit growth and development.

Cucumber;gene; bioinformatics analysis

S642.2

A

1000-2324(2021)03-0358-06

2021-03-22

2021-03-25

國家自然科學基金(31972419;31672170);山東“雙一流”專項建設基金(SYL2017YSTD06);山東省泰山學者建設工程(ts20130932);山東省重點研發計劃(2018GNC110014)

李豪(1993-),男,碩士研究生,研究方向:分子遺傳育種. E-mail:18763829737@163.com

Author for correspondence. E-mail:zhren@sdau.edu.cn; lnwang@sdau.edu.cn