游離長鏈非編碼RNA TUG1在結直腸癌的表達及其對化療敏感性的影響

崔瑛，王曉輝，劉艷霞

（許昌市人民醫院1.質控辦；2.血液腫瘤科；3.護理部，河南 許昌 461000）

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤,其發病與遺傳因素、飲食運動等生活方式和老齡化密切相關，近年來隨著經濟發展、環境污染加劇和人口老齡化，其發病率亦呈上升趨勢[1]。結直腸癌治療以手術切除為主,對于手術無法根治的患者采用術后輔助化療作為一線治療方案，然而很多患者在化療幾個周期后會出現耐藥情況，嚴重影響到治療和預后[2,3]。牛磺酸上調基因1(Taurine up-regulated gene 1，TUG1)是長鏈非編碼RNA的一種，既往研究發現TUG1與多種癌癥的發生發展有關，它能通過誘導癌細胞轉移和上皮-間質轉化促進結直腸癌的進展[4-6]。本研究通過測定結直腸癌患者血清游離TUG1表達與體外癌細胞下調TUG1對化療敏感性的變化，來探討TUG1的表達與結直腸癌患者病情和化療耐藥的關系，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料2018年5月-2019年4月本院收治的結直腸癌患者137例作為研究對象，納入標準：所有患者均接受了手術切除治療，均經術后病理證實為結直腸癌。其中男性為73例，女性64例，年齡為32～87歲，平均為63.21±4.27歲。另收集100例同期在本院體檢健康者血清作為對照，其中男性52例，女性48例，年齡為33～85歲，平均為62.89±5.13歲。結直腸癌組患者與健康體檢者年齡和性別比較，差異無統計學意義（P＞0.05），一般資料具有可比性。本研究已通過倫理委員會審查。

1.2 試劑與儀器 人結直腸癌細胞系SW620購自中國科學院上海細胞庫，培養液選用Leibovitz’s L-15培液（添加10%胎牛血清），購自上海玉博生物科技有限公司。R1200總RNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，轉染試劑采用Lipofectamine3000購自美國Invitrogen公司。PCR引物合成在生工生物完成，RNA反轉錄試劑盒與RTqPCR試劑盒均購自德國Qiagen公司。TUG1抑制劑Smart Silencer-TUG1（ss-TUG1）及陰性對照ss-NC購自廣州銳博生物科技公司；CCK8試劑盒購自南京固與生物；順鉑（Cisplatin，DDP）購自大連美侖生物技術有限公司。

恒溫恒濕箱采用無錫瑪瑞特科技有限公司LRH-150HC，酶標儀選用賽默飛世爾科技FC型酶標儀，RT-qPCR儀采用美國Applied Biosystems公司的ABI7500。

1.3 研究方法

1.3.1 結直腸癌患者和體檢健康人群血清TUG1相對表達量的測定 結直腸癌患者入院接受手術治療前采血后立即分離血清，采用RNA提取試劑盒提取血清中的總RNA，逆轉錄成cDNA后進行RT-qPCR，讀取Ct值，采用2–ΔΔCT計算TUG1相對表達量，采集到的健康體檢者靜脈血亦采用同樣的方法測定血清TUG1相對表達量。TUG1基因的上游引物為5'-GGCUUCUAUUCUGAAUCCU-3'，下游引物為5'-AGGAUUCAGAAUAGAAGC-3'；內參基因選用β-actin。

1.3.2 細胞系DDP敏感性與TUG1表達關系的測試 將SW620細胞系于溫度37℃，含有5%CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞（5×104/ml）100μl/孔接種于6孔板，常規培養24h后，按照Lipofectamine3000轉染試劑盒說明書分別采用TUG1抑制劑（Smart Silencer-TUG1，ss-TUG1）和陰性對照（Smart Silencer-negative control，ss-NC）轉染人結直腸癌SW620細胞系,構建TUG1低表達SW6 20-TUG1組和正常表達SW620-NC組。兩組細胞常規培養5～6h，置換新的培養液，繼續培養24h后，采用RT-qPCR檢測兩組細胞TUG1的表達量，每組各檢測3個復孔并重復檢測3次。

同時將轉染后的兩組細胞懸液按照1×105個細胞/孔接種于96孔板，每孔100μl，各4板，進行常規培養。次日分別給予0mg/L（空白）、10mg/L、25mg/L、50mg/L、75mg/L和100mg/L的順鉑（DDP）處理，每個濃度3個復孔，在DDP處理的0h、24、48與72 h，各取出1板加入CKK8溶液于37℃孵育2h，酶標儀檢測490nm處吸光度值（OD值），上述測量值均重復測量3次。

1.4 觀察指標TUG1表達與結直腸癌病情的關系：對比結直腸癌患者和體檢健康人群血清TUG1含量的差異，并分析結直腸癌患者TUG1表達量與患者的臨床病理特征的關系。

TUG1表達與結直腸癌細胞對DDP敏感度的關系：對比轉染培養后SW620-NC與SW620-TUG1兩組細胞TUG1相對表達量，采用Graph-PadPrism5.0計算72h時半數抑制濃度（inhibitory concentration of 50%，IC50），比較10mg/L的DDP用藥后不同時間點OD值的變化，計算10mg/L DDP的生長抑制率=（加藥-空白）/空白×100%。

1.5 統計學處理 采用SPSS21.0軟件，結直腸癌患者血清TUG1與臨床病理特征關系的分析采用單因素分析中的卡方檢驗（χ2），血清及細胞系TUG1表達量（）采用t檢驗進行比較，組間不同時間點比較先采用重復測量數據的方差分析，再采用t檢驗進行比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌患者和體檢健康人群血清TUG1相對表達量的比較 結直腸癌患者血清TUG1相對表達量為6.11±0.23，體檢健康人群血清TUG1相對表達量為2.76±0.24，結直腸癌患者血清TUG1相對表達量高于體檢健康人群，差異有統計學意義（t=114.151，P＜0.05）。

2.2 結直腸癌患者血清TUG1與臨床病理特征的關系 以結直腸癌患者血清TUG1相對表達量的平均值6.11為界，將結直腸癌患者分為高表達組（TUG1相對表達量＞6.11）和低表達組（TUG1相對表達量＜6.11）。結果顯示，血清TUG1表達高低與性別、年齡和腫瘤大小無關（P＞0.05），與癌組織分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和是否遠處轉移有關（P＜0.05），見表1。

表1 結直腸癌患者血清TUG1與臨床病理特征的關系

2.3 SW620-NC與SW620-TUG1細胞TUG1相對表達量的比較ss-TUG1和ss-NC轉染SW620細胞系構建SW620-TUG1細胞與SW620-NC細胞后，采用RT-qPCR檢測TUG1相對表達量，顯示SW620-TUG1細胞中TUG1相對表達量為1.19±0.28；明顯低于SW620-NC細胞3.07±0.35，差異有統計學意義（t=7.265，P=0.001），表示通過轉染成功下調了TUG1表達。

2.4 SW620-NC與SW620-TUG1細 胞IC50的 比較DDP處理72h后軟件計算得到兩組細胞的IC50，SW620-TUG1組的IC50為23.18±2.19mg/L，SW620-NC組為75.29±3.72mg/L,SW620-TUG1組的IC50低于SW620-NC組，差異有統計學意義（t=20.908，P＜0.001）。

2.5 SW620-NC與SW620-TUG1細胞用藥后不同時間點OD值的變化DDP用藥后0h、24h、48h和72h，SW620-TUG1組OD值均明顯低于SW620-NC組，差異有統計學意義（P＜0.05），且隨著時間的推移，兩組細胞間OD值的差異越來越大，見表2和圖1。

表2 SW620-NC與SW620-TUG1細胞10mg/L的DDP用藥后不同時間點OD值

圖1 10mg/L DDP用藥后不同時間點OD值的比較

2.6 SW620-NC與SW620-TUG1細胞在不同時間點生長抑制率的比較48h和72h測得SW620-TUG1細胞的生長抑制率明顯高于SW620-NC，差異有統計學意義（P＜0.05），且隨著時間的推移，兩組間差異越來越大，見表3、圖2。

圖2 DDP用藥后不同時間點生長抑制率的比較

表3 SW620-NC與SW620-TUG1細胞不同時間點生長抑制率的比較

3 討論

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，據WHO最新數據統計其發病率在惡性腫瘤中高居第四，致死率高居第三，嚴重危害人類生命健康[7]。結直腸癌具有很強異質性，個體基因的改變可能與其病理組織學特征及對化療藥物的敏感度都密切相關，因此對結直腸癌患者化療前檢測相關基因的表達對其選擇治療方案和預后的改善都能起到一定幫助[8]。

長鏈非編碼RNA雖然不編碼蛋白質，但其在各種生物活動和疾病進展中發揮著重要的調節作用，包括癌細胞的耐藥性[9]。TUG1作為長鏈非編碼RNA的一種,近年來也逐步受到臨床和科研的廣泛關注。既往研究表明,TUG1呈高表達的食管鱗癌患者對化療敏感性較差，胃癌組織中TUG1通過沉默P57表達從而促進胃癌發生與進展，TUG1還能通過介導上皮-間充質轉換促進癌細胞轉移[10-12],故推測結直腸癌患者癌癥的發展和對化療敏感性也可能與TUG1的表達有關。血清游離TUG1與組織TUG1表達呈正相關[13]，且樣本容易獲取，還能實現表達狀態的監測，因此本研究采用血清TUG1水平反映患者癌組織TUG1的表達。

結果發現，結直腸癌患者血清TUG1表達量明顯高于健康體檢者,且其表達的高低與癌組織分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和是否遠處轉移均有關。低分化癌組織中TUG1表達量高于高分化癌組織，癌細胞浸潤程度高的TUG1表達量高于浸潤程度較低的，發生淋巴結轉移的患者TUG1表達高于未發生轉移的，發生遠處轉移的TUG1表達高于近端轉移。總之癌癥病情越嚴重，組織病理學分級越高，TUG1表達量越高，這與姚凱、Jiang L等人[6,10]通過對結直腸癌患者組織中TUG1表達和患者臨床病理特征之間關系進行分析得出的研究結果相符。Qin CF等人[13]對結直腸癌患者血清與組織中的TUG1含量進行比較發現，確實呈現明顯正相關關系，且血清與組織中的TUG1含量均與患者術前TNM分期顯著相關,提示術前血清TUG1亦可一定程度上反映結直腸癌的病情的嚴重程度，這將為后續結直腸癌術前診斷帶來便利。TUG1在癌癥的發生和進展中發揮著作用，調控機制可能與TUG1的競爭性抑制作用有關,它可以促進一系列微小RNA調控的靶蛋白的表達，增強Wnt/β-連環蛋白途徑的活性和下游基因轉錄的核定位,促進腫瘤細胞的的增殖，通過激活內皮-間充質相關基因表達，增加癌細胞遷移和侵襲能力，從而促進癌癥進展[14,15]。

DDP是一種鉑類抗癌藥物,屬于細胞周期非特異性藥物，能夠通過干擾DNA復制殺死無限增殖的腫瘤細胞,是包括結直腸癌在內的多種癌癥一線化療藥物。通過體外細胞培養進行DDP敏感性實驗發現，SW620-TUG1細胞系中TUG1的表達受到抑制，DDP用藥前OD值已明顯低于SW620-NC細胞，說明TUG1的表達與癌細胞生長和增殖活性呈 正 相 關。DDP用 藥 后24h、48h、72h，SW620-TUG1細胞與SW620-NC細胞OD值差異隨著時間增加而增大；相比TUG1高表達的SW620-NC細胞，TUG1低表達的SW620-TUG1細胞經DDP處理72h的IC50明顯降低，且生長抑制率明顯升高,下調TUG1的表達能增強DDP對癌細胞的抑制率，揭示了TUG1高表達介導了結直腸癌細胞對DDP抗性,這可能同樣與TUG1介導癌細胞增殖和轉移有關,與DDP藥物作用形成了競爭性拮抗關系，同時TUG1促進腫瘤細胞上皮間質轉化，使得腫瘤細胞獲得了腫瘤干細胞特性,從而減弱了DDP對細胞周期干擾效果[10]。Fukuda Y等人研究[16]指出腫瘤細胞的耐藥性與ABC轉運蛋白超家族介導藥物轉運系統改變有關，而近期Li C等學者研究[17,18]表明TUG1是通過mir-186/cpeb2軸介導結直腸癌的甲氨蝶呤化療抵抗，亦有Niu Y等學者研究[12]指出，TUG1能在非小細胞肺癌中通過招募相關因子，促進組蛋白甲基轉移酶活性，誘導LIMK2b基因啟動子甲基化從而抑制其轉錄,促進腫瘤細胞增殖，并誘導其化療抵抗，但其在結直腸癌中的具體調控信號通路是否也與肺癌中一致,仍有待進一步實驗研究。此外，結果中還可以發現DDP作用48h和72h后SW620-TUG1細胞與SW620-NC細胞生長抑制率差異顯著，SW620-NC細胞隨著時間延長對DDP的敏感性降低，進一步說明了高表達的TUG1與癌細胞對DDP耐藥相關。

綜上，TUG1在結直腸癌患者血清中表達上調，與患者病情嚴重程度密切相關，進一步實驗顯示下調TUG1能增加癌細胞對DDP的敏感性，從而增強DDP的細胞毒性。本研究可為結直腸癌化療藥物DDP敏感性測試提供新的靶點,也為日后化療的個體化用藥提供一定參考意義,未來可能通過監測結直腸癌患者血清TUG1表達量選擇或及時調整其術后化療方案。