MMP2在胃癌干細胞中表達水平變化意義

馬果果，馬志強，李忍萍

（河南科技大學第二附屬醫院消化內科，河南 洛陽 471000）

我國是胃癌（gastric carcinoma）高發國家，每年新發病例占全球的40%[1]。近年來，隨著對惡性腫瘤研究的不斷深入，越來越多的學者認為，腫瘤干細胞也具有固體腫瘤特征，胃癌可能是一種干細胞疾病[2]。因此研究胃癌干細胞內的自我更新相關分子信號通路，對于胃癌的針對性治療具有重要意義。胃癌的高侵襲性、高轉移性及高復發性是本病高致死率的主要因素。基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)是基質金屬蛋白酶之一，能降解細胞外基質。MMP-2是腫瘤侵襲、轉移以及腫瘤供血血管新生過程中的重要參與因子[3]。研究顯示[4],MMP2可能是腫瘤干細胞生物學活性的重要促進因子。但是MMP2對胃癌干細胞的影響，以及在胃癌發生發展中的作用機制少有報道，因此本研究探討MMP2在胃癌干細胞中表達水平的意義，報告如下。

1 材料與方法

1.1 胃癌細胞系 選取胃癌MNK28細胞系，購自第四軍醫大學西京醫院全軍消化研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 胃癌細胞系MKN28解凍后，置于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基內進行培養,培養環境如下：37℃飽和濕度，CO 2體積分數為5%,每兩天傳代一次。2.5g/L胰蛋白酶進行消化、傳代。

1.2.2 無血清懸浮培養 取胃癌細胞系MKN28對數生長期的細胞制成單細胞懸液，PBS洗兩次之后，置于含EGF(15ng/ml)、bFGF(8ng/ml)、B27(1∶50)的DMEM/F12無血清培養基內，隨后以500個/孔接種于低黏附24孔板中,在37℃、50ml/L CO2孵箱中培養，每4d換液1次。

1.2.3 質粒轉染 取胃癌細胞系MKN28對數期生長的細胞，鋪到6孔板，每孔35萬個細胞，使用LipofectaminTM 2000轉染，操作步驟參照相應說明書。

1.2.4 Western blot檢測 將無血清培養1周后發育成形的懸浮球取出，置于15 ml離心管中，選用細胞裂解液進行裂解，純化后采用4～12% Bis-Tris蛋白質進行電泳凝膠操作，電泳電壓120V，當溴酚藍前沿接觸到分離膠底部時停止。30V室溫下進行轉膜操作，持續1h，5%脫脂奶封閉，TBST漂洗后進行一抗操作，試劑為MMP2(sc-80210)小鼠抗人單克隆抗體(1∶500)，內參為MMP2(1∶2000)，4℃過夜孵育，隨后選用HRP偶聯進行二抗，室溫環境中孵育1h，TBST漂洗，按ECL化學發光試劑盒(Santa Cruz公司)內附說明書進行顯色,采用Alpha Imager 2200軟件對結果進行分析。

1.2.5 無血清懸浮培養成球實驗 取MKN28胃癌細胞樣本接種到96孔板中，每孔1000個細胞。無血清環境懸浮培養，時長1周，隨后記錄每個孔懸浮球數目。

1.2.6 平板克隆實驗 將MKN28胃癌細胞樣本接種至8 cm細胞培養皿內，每孔細胞數約2000個。培養2周后，克隆計數。

1.3 統計學處理 統計采用SPSS19.0軟件，MMP2相對表達等資料采用（)表示，組間比較使用方差分析，檢驗水準α為0.05。

2 結果

2.1 懸浮球細胞和普通貼壁細胞MMP2表達MKN28胃癌細胞在無血清、低粘附環境內，依然有較少數細胞可形成懸浮球體，隨培養時間延長，球體增大。懸浮球MKN28細胞MMP2表達量明顯高于貼壁MKN28細胞（P＜0.05），見表1、圖1。

表1 懸浮球細胞和普通貼壁細胞MMP2表達

圖1 Western blot檢測圖（A：懸浮球細胞；B：貼壁細胞）

2.2 質粒轉染后MMP2表達 轉染組MMP2表達量明顯低于對照組和空白轉染組（P＜0.05）。見表2、圖2。

圖2 Western blot檢測圖（A：轉染組；B：空白轉染組；C：對照組）

表2 質粒轉染后MMP2表達

2.3 質粒轉染后細胞懸浮成球率 轉染組細胞懸浮成球率明顯低于對照組和空白轉染組（P＜0.05）。見表3、圖3。

表3 質粒轉染后細胞懸浮成球率

圖3 細胞懸浮成球率檢測圖（A：轉染組；B：空白轉染組；C：對照組）

2.4 質粒轉染后細胞克隆形成率 轉染組細胞細胞克隆形成率為（2.82±0.89）%，明顯低于對照組和空白轉染組（P＜0.05）。見表4、圖4。

表4 質粒轉染后細胞克隆形成率

圖4 細胞克隆形成率檢測圖（A：轉染組；B：空白轉染組；C：對照組）

3 討論

腫瘤，尤其是惡性腫瘤復發是本病治療難點之一，隨著對惡性腫瘤發病機制研究的深入，大量研究表明[5,6]，腫瘤本質可能是一種干細胞疾病。腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)是一種可進行自我更新，并可啟動腫瘤生成的細胞，雖僅占腫瘤細胞的極少部分，但是由于其具有對放化療的抵抗、高轉移等特點，因此腫瘤干細胞活性對于對腫瘤的存活、增殖、轉移及復發有著重要作用。目前研究顯示[7,8]，腫瘤干細胞存在于多種惡性腫瘤中，例如結腸癌、肝癌、乳腺癌以及肺癌等。研究腫瘤干細胞內具有自我更新作用的相關子信號通路對于闡明腫瘤干細胞的調控機制，帶來腫瘤治療療效的突破具有重要意義。

研究顯示[9]，胃干細胞是一種具有自我更新、復制能力細胞。胃癌的侵襲和轉移機理與胃干細胞自我更新能力有一定相關性。基質金屬蛋白酶家族與上皮間質轉型(epithelial mesenchymal transition,EMT）過程息息相關，而EMT與惡性腫瘤侵襲、轉移能力密切相關。細胞外基質(extracellular matrix,ECM)屏障則是腫瘤細胞侵入其他血管的必要過程，而MMPs促進ECM降解。研究顯示[10,11]，MMPs改變了腫瘤細胞的微環境，促進了腫瘤的侵襲和轉移。MMP2與胃癌密切相關的一種基質金屬蛋白酶，MMP2可以降解Ⅳ型膠原，它是脈管基底膜的一種重要的組成成分。研究顯示[12]，MMP2表達水平直接影響著胃癌浸潤深度、淋巴結轉移程度，MMP2促進淋巴結轉移。Jiang[13]等研究顯示，MMP2可以增強胃癌的侵襲、轉移能力。但是目前尚未證實MMP2在胃癌腫瘤干細胞自我更新中的作用機制。因此本研究設計一系列實驗探討MMP2在胃癌干細胞中表達水平的意義。體外克隆球生成能力是當前應用最廣的腫瘤干細胞鑒定方案。細胞在體外無血清、低粘附培養條件下，如該細胞可生成克隆球則表示其具有自我更新能力[14]，即屬于腫瘤干細胞表現型。本組研究發現，MKN28胃癌細胞在無血清、低粘附培養條件下，依然有較少數細胞可形成懸浮球體，證實了該細胞屬于腫瘤干細胞表現型。Western blot檢測發現，懸浮球MKN28細胞MMP2表達量明顯高于貼壁MKN28細胞（P＜0.05）；表明MMP2在胃癌干細胞樣細胞中呈現高表達，進一步證實本研究所分離的是干細胞樣亞群。與Rybarczyk[15]等研究結果相一致。通過對轉染組轉染MMP2干擾質粒，空白轉染組轉染空白質粒，結果顯示，轉染組MMP2表達量明顯低于對照組和空白轉染組（P＜0.05）；轉染組細胞懸浮成球率明顯低于對照組和空白轉染組（P＜0.05）；轉染組細胞細胞克隆形成率明顯低于對照組和空白轉染組（P＜0.05）。表明MMP2在胃癌干細胞樣細胞中的高表達特征與干細胞自我更新能力和增殖能力密切相關，但具體的作用機制尚需進一步研究。

綜上所述，MMP2在胃癌干細胞樣細胞內存在明顯高表達現象，并且與干細胞自我更新和增殖能力密切相關。