芽孢桿菌處理對柑桔苗木黃龍病抑制效果

胡黨振 徐嬡媛 于夢怡 姜 玲

(華中農業大學 園藝林學學院/園藝植物生物學教育部重點實驗室/國家果樹脫毒種質資源室內保存中心/農業農村部華中地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室, 武漢 430070)

柑桔黃龍病是毀滅性病害，迄今已有53個國家相繼報導了此病害[1-3]。在美國弗羅里達州柑桔黃龍病導致產量減半[2]，在巴西柑桔黃龍病導致3 800萬株柑桔樹被毀[4-5]。在我國柑桔主產區，江西贛南柑桔黃龍病已累計造成約12億元經濟損失[6]。柑桔黃龍病是韌皮部桿菌引起的病害，其病原是一種革蘭氏陰性菌CandidatusLiberibacter spp，分為3個種，包括亞洲種C.Liberobacter asiaticus(Las)、非洲種C.Liberobacter africanum(Laf)和美洲種C.Liberobacter americanus(Lam)，其中亞洲種為害柑桔最嚴重。由于韌皮部桿菌Las純化和培養難度大，因此，黃龍病病原學及致病機理研究進展緩慢。目前柑桔黃龍病的防治主要采用挖除病樹、控制木虱傳播和培育無病苗木等方法。在全球氣候變曖的新形勢下，由于發生柑桔黃龍病與衰退病、黃脈病的復合侵染越來越多，對柑柑無病苗木的需要越來越大，迫切需要改進脫毒技術，提高脫毒效率。

生防菌是指能夠控制病害發展的有益微生物，具有對環境友好、可持續發展的特點[7]。國內外已有研究表明芽孢桿菌在植物病害的防控上有顯著的效果。芽孢桿菌主要通過競爭、誘導、拮抗和促生等發揮生防作用，提高植株的抗病性[8-9]。常用作生防菌的種類主要有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)及多粘類芽孢桿菌(Paenibaci)等[10]。貝萊斯芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的一個新種，其次生代謝產物對病原菌可產生廣譜抗性，能產生IAA、NH3和ACC脫氨酶等植物激素以及抗菌物質和酶[11]。Kim等[12]從種植蘑菇的廢料中分離出貝萊斯芽孢桿菌M75，其基因組包含編碼各種非核糖體肽合成酶和聚酮化合物合成酶的操縱子。由于植物具有自身免疫系統，在病原菌侵染位點能發生過敏反應，使整株植物產生系統獲得性抗性(Systemic acquired resistance， SAR)或誘導系統抗性(Induced sstemic resistance， ISR)，誘導系統抗性可以由非致病性根際微生物誘發植物抗病反應[13,14]。從植物根際分離的貝萊斯芽孢桿菌大部分可以在植物根部定殖，對抑制病原菌起著重要作用[15]。據報道，植物生長促進(PGP)甲基營養型微生物也可以有效緩解不同類型的生物和非生物脅迫，但直接采用芽孢桿菌影響黃龍病病原的研究報導甚少[16]。本課題擬利用芽胞桿菌處理柑桔苗木，篩選對柑桔黃龍病有抑制作用的菌株，通過多次、高強度的處理及處理前后黃龍病病原的分子檢測，尋找控制和降低母本植株黃龍病病原滴度的方法，為提高后續脫除病原的效率打下良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用一年生‘沃柑’(Citrus.reticulataBlanco)、‘沙糖橘’(C.reticulatacv. Shiyue Ju)、‘南豐蜜橘’(C.reticulatacv. Kinokuni)作為試材，苗木均隔離種植于華中農業大學微生物農藥國家工程研究中心大棚內。

1.2 菌株的分離、鑒定及結構觀察

對華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室提供的生防復合菌進行分離、純化，根據《微生物學實驗》[17]，配置培養基，將生防復合菌用涂布和劃線的方法進行多次分離和純化，分離到不同單菌落。對No.4單菌落進行革蘭氏染色試驗、細菌純培養鑒定和分類鑒定。細菌樣品的掃描電鏡觀察參考《掃描電鏡的微生物樣品制備方法》[18]。根系石蠟切片觀察參考《植物顯微技術指導書》[19]進行，切片用奧林巴斯BX53型生物顯微鏡進行觀察。對No.4 菌株進行發酵培養。將單菌落接種到LB培養基中，在37 ℃，200 r/min的條件下搖瓶培養，當菌液的OD600 nm≈1時，取20 mL菌液加入高壓滅菌后的培養基中。培養基為1 kg米糠、1 kg麩皮、0.6 kg 淀粉、0.4 kg豆粕、15 g紅糖，按照m(培養基)∶m(水)=1∶1.3混合均勻。在32 ℃發酵8 d，每天攪拌1次。將培養物置于60 ℃干燥，使用800A型粉碎機(浙江省永康市)粉碎后待用。檢測活菌數約為100億個/g。

1.3 苗木管理及菌劑處理

供試苗木均為一年生嫁接苗，砧木為枳殼。苗木的生長條件基本一致，每月每株苗施5 g復合肥，共施8 次。用200 mg/L聚-γ-谷氨酸(PGA)溶液(300 mL/株)和80 mg/L殼寡糖溶液(300 mL/株)每隔10 d灌根1次，共3 次。分別于2019年4月、5月、6月用海藻肥600倍稀釋液噴葉3次，上述管理作為基本管理措施，在處理和對照苗木上均同樣使用。No.4菌劑使用時用水稀釋后及時灌根。用量為0.5 L/株，每周1次。‘沃柑’和‘沙糖橘’都進行菌劑灌根處理21次，操作方法為，1.6 g/L，3次；2.5 g/L，7次；5 g/L，11次。24 h后從4個方向采集葉脈，用液氮冷凍，待用； ‘南豐蜜橘’用菌劑灌根處理14次，具體操作時，用量是1.6 g/L，10次；2.5 g/L，4次，用量為0.5 L/株。對照植株全部用等量的清水灌根。采集葉脈和枝皮用液氮冷凍，分別磨樣，用于黃龍病分子檢測。

1.4 柑桔黃龍病的分子檢測

PCR檢測程序：冷凍樣品加液氮磨碎，用CTAB法提取植物總DNA。采用Bio-Rad(美國)PCR儀進行檢測，使用(OI1/OI2C)和(P400+/P400-)2對引物分別進行PCR擴增，引物序列(見表1)引物由上海生物工程股份有限公司合成。反應采用翊圣生物科技有限公司試劑盒。PCR反應程序為95 ℃，變性3 min，60 ℃，退火30 s，72 ℃, 延伸1 min，共35個循環。用健康柑桔愈傷組織提取DNA作負對照，分別用質粒pMD18-16S rDNA和質粒pMD18T-P400做正對照。

表1 柑桔黃龍病檢測和抗病相關基因表達量分析所用引物Table 1 Primers used for the detections of Huanglongbing disease and disease-resistant genes

qPCR檢測程序：用Corbett RG 6000實時熒光定量PCR儀(德國)進行擴增，細胞色素氧化酶基因COX作看家基因，柑桔黃龍病亞洲型核糖體蛋白基因rpLJ/rp1L作目的基因[20, 21]，引物見表1，設置3個重復，以健康愈傷組織為負對照，對目標基因已測序比對的DNA樣品為陽性對照。qPCR反應程序為94 ℃變性3 min，94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，40個循環。根據文獻[22]計算目標基因的相對表達量。負對照的2-ΔΔCT=1，當待測樣品2-ΔΔCT>1，則樣品為陽性，當0<2-ΔΔCT<1則樣品為陰性。

1.5 植株抗性相關基因表達量測定

當南豐蜜橘經No.4菌劑處理后，在0、12、24、36 h時取樣，各3個生物學重復。提取RNA后進行反轉錄，cDNA作模板進行實時熒光定量PCR擴增。測定PR1、HSP90、GST1、WRKY22、WRKY24、WRKY29和WRKY33的mRNA相對表達量，引物序列見表1。擴增程序為94 ℃ 3 min，94 ℃ 5 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，35個循環，72 ℃ 10 min，40 ℃ 10 s。每份樣品3次重復，數據用Excel 2016軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 生防菌菌株分離、純化和鑒定

從生防復合菌中分離出不同的單菌落，通過光學顯微鏡觀察發現No.4菌落呈圓形，乳白色，半透明狀，邊緣整齊，表面光滑(圖1(a))；革蘭氏染色結果為陽性(圖1(b))；掃描電子顯微鏡觀察發現菌落為桿狀，有芽孢，聚合呈鏈狀，具圓端，大小為0.6 μm×(1.3～3.0)μm，有二分裂狀態(圖1(c))。

(a)菌落乳白色，半透明狀；(b)革蘭氏染色為陽性；(c)掃描電鏡觀察(a) The colonies are opalescent and translucent; (b) Gram staining result is positive; (c) Scanning electron microscope observation圖1 No.4菌落形態特征Fig.1 Morphological characteristics of No.4 bacterial colonies

2.2 No.4菌落細菌純培養鑒定

對No.4菌株部分生理生化指標進行鑒定，結果顯示(表2)：該菌株可利用明膠酶分解明膠；能利用丙二酸鹽作為碳源；可在檸檬酸鹽培養基上生長；葡萄糖氧化發酵試驗表明No.4菌落為發酵型；可以合成淀粉酶，利用淀粉。甲基紅試驗結果為陰性。VP試驗結果為陰性，表明該菌劑利用葡萄糖不能產生有機酸，能產生非酸性或中性末端產物。再結合其形態特征，初步鑒定No.4菌株為芽孢桿菌屬。

表2 No.4菌株部分生理生化指標Table 2 The physiological and biochemicalindicators of strain No.4

2.3 No.4菌株16S rDNA和recA基因測序

對No.4菌株的16S rDNA和recA基因進行序列分析，其16SrDNA片段測序后大小約為1 608 bp(附錄)，經NCBI 序列比對，構建系統發育樹，No.4菌劑與貝萊斯芽孢桿菌recA同源性達93%(圖2(a)和2(b))，且其生理生化指標也符合芽孢桿菌屬特征，因此，推測該菌株為貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)。

系統發育樹上數字為序列同源性的百分數。The number in the phylogenetic tree is the percentage of sequence homology.圖2 No.4菌株16S rDNA和 recA 基因序列系統發育樹構建Fig.2 Construction of phylogenetic tree of 16S rDNA and recA gene sequence of strain No.4

2.4 No.4菌劑處理前后韌皮部桿菌中目標基因的檢測分析

對苗木的葉脈取樣后，利用qPCR檢測HLB病原，同時又采用(OI1/OI2C)和(P400+/P400-)2對引物進行PCR擴增。由于病原在植株不同器官中分布和濃度是不穩定的，為了減少檢測誤判，本研究采用3種方法，從而避免漏掉陽性材料， 上述3種方法檢測中只要有一種表現陽性，即認為該植株為陽性。結果表明：No.4菌劑處理的‘沃柑’植株，黃龍病陽性率由處理前100%降至處理后的50%，對照植株陽性率保持不變(表3)。No.4菌劑處理的‘沙糖橘’植株，其陽性率由處理前的100%降至處理后的75%，對照陽性率不變(表4)；‘沃柑’處理組植株植株長勢茂盛，根部發達，新生根數量明顯多于對照組，根部褐變程度明顯改善(圖3(a)～(h))。沙糖桔苗木經No.4菌劑處理后，根系發達，須根豐富，而對照苗木新根少，苗木長勢弱，根系密度低(圖3(i)～(l))。

(a) No.4菌劑處理的沃柑植株；(b)對照植株；(c),(e)和(g)處理植株的根系；(d),(f)和(h)對照植株的根系；(i)和(k)No.4菌劑處理沙糖桔及其根部放大照片；(j)和(l)對照植株及其根部放大照片。A：(a) The ‘orah’ plant is treated by No.4 Bacillus agent; (b) Control; (c), (e) and (g) The roots of the control groups; (d), (f) and (h) The roots of control group; (i) and (k) ‘shiyue’ ju plant is treated by No.4 Bacillus agent and the enlarged photo of root; (j) and (l) The control plant and the enlarged photo of root.圖3 No.4菌劑處理對沃柑和沙糖桔根系的影響Fig.3 Effect on root growth condition after treatment by No.4 Bacillus agent in ‘orah’ and ‘Shiyue Ju’

2.5 No.4菌劑處理后南豐蜜桔黃龍病病原檢測結果和根部特征的變化

No.4菌劑處理前，通過qPCR方法，對南豐蜜桔葉脈和枝皮進行黃龍病分子檢測，發現供試材料均為陽性；No.4菌劑處理后，黃龍病的陽性率為66.7%，對照樣品處理前和處理后均為陽性。

No.4菌劑處理后南豐蜜橘植株根系生長旺盛，須根發達，根系褐變現象減輕(圖4(a)～(c))，對照苗木根密度小，褐變較重(圖4(d)～(f))，圖4(g)和4(h)為褐變根系放大照片。通過掃描電鏡觀察菌劑處理后‘南豐蜜橘’植株根部褐變部分與正常部分結構差異，分析菌劑對根系生長的影響。由(圖4(i)和4(j))可以看出，褐變部位根部表面粗糙，細胞呈磷片狀翹起，部分細胞結構不完整，細胞壁被破壞，韌皮部篩管有內含物(圖4(m))。No.4菌劑處理后健康部位根部表面光滑完整，表皮細胞呈長方形，細胞壁結構無破損，韌皮部篩管表現正常(圖4(k),4(l)和4(n))。

經No.4菌劑處理后，選取褐變根和表現正常的根制備石蠟切片，不管是處理組還是對照，褐變根的薄壁細胞均呈現不規則的空泡狀(圖4(o)和4(q))，而外觀表現正常的根，其內部結構沒有遭到明顯的破壞(圖4(p))，但表皮細胞有開裂癥狀(圖4(r))。

(a)～(c) No.4菌劑處理的植株;(d)～(f)對照植株;(g)和(h)褐變根放大照片;(i)～(n)菌劑處理后電鏡照片;(i)和(j)褐變部位根部表面;(k)和(l)健康部位根部表面;(m)褐變部位根部橫切面;(n)健康部位根部橫切面;(o)～(r)石蠟切片照片;(o)和(p)菌劑處理后橫切面;(o)褐變部位根面;(p)正常部位;(q)和(r)對照樣品中橫切面;(q)褐變部位;(r)正常部位。(a)-(c): No.4 Bacillus agent-treated plants; (d)-(f): Control plants; (g) and (h): Enlarged photos of browning roots; (i)-(n): Electron microscopy images; (i) and (j): The root surfaces of the browning parts; (k) and (l): The root surfaces of normal parts; (m): The transverse root section of browning part; (n): The transverse root sectionof of normal part; (o)-(r): Paraffin section photographs; (o) and (p): The transverse sections of the roots after treatment with No.4 Bacillus agent; (o): Browning part; (p): Normal part. (q) and (r): The transverse sections of the control; (q): Browning site; (r): Normal site.圖4 No.4菌劑處理南豐蜜橘苗木特征及根部顯微結構觀察Fig.4 Morphological characteristics of ‘Nanfengmiju’ tangerine plants and microstructural observation after treatment by No.4 Bacillus agent

2.6 相關抗性基因表達量分析

分析qPCR結果發現(圖5)：南豐蜜桔菌劑處理組PR1基因和WRKY29基因mRNA表達水平低，且對照組高于處理組，菌劑誘導PR1基因和WRKY29基因下調表達；處理組HSP90轉錄水平0～36 h一直下調，但在0 h和36 h時比對照組表達水平高，在12和24 h時比對照組表達水平低。處理組GST1基因表達水平在12 h時達最低，之后有升高趨勢，在0和36 h時，表達量略高于對照組，表明菌劑誘導GST1基因表達具有一定效果；處理組WRKY22轉錄因子隨處理時間延長，表達量持續升高，在12和36 h時高于對照組，表明菌劑處理有助于提高WRKY22轉錄因子的表達豐度；處理組WRKY24轉錄因子表達量在12和36 h時有上升趨勢，并且在36 h時表達量高于對照組，表明菌劑處理能夠誘導植株WRKY24基因表達。處理組WRKY33轉錄因子在12 h時表達上調，之后表達量下降，在36 h時表達量高于對照組，表明菌劑處理能夠誘導植株WRKY33基因表達。

柱子上方小寫字母不同時，說明基因相對表達量的差異達到顯著水平(P<0.05)。Different lowercase letters at the top of the column indicate significant differences (P<0.05).圖5 No.4菌劑處理對植株抗性基因mRNA表達量影響Fig.5 Effect of strain No.4 on mRNA relative expression of plant resistance genes

3 討論與結論

本研究從復合菌分離出單菌落，經發酵制備的No.4菌劑用于柑桔盆栽苗木灌根處理，探討了No.4菌劑對黃龍病的控制效果。

3.1 貝萊斯芽孢桿菌No.4菌劑可以影響韌皮部桿菌致病基因的表達

已有研究發現貝萊斯芽孢桿菌在抑制多種植物病原體和促進植物生長方面具有重要作用，其產生的次生代謝物可引發植物誘導的系統抗性，從而增強植株的抵抗力[23-24]。如：B.velezensis5113可改善小麥在非生物脅迫下的存活率和耐受性[25]。本研究顯示‘沃柑’和‘沙糖橘’植株在貝萊斯芽孢桿菌No.4菌劑處理21次后，葉脈中病原關鍵基因的相對表達量分別下降到50%和75%，而在自然狀態下，植株不容易靠自身的抵抗力達到降低韌皮部桿菌病原基因的相對表達量的效果，因此，貝萊斯芽孢桿菌No.4菌劑的使用可能改善了根際環境，誘導柑桔植株的抗黃龍病能力。

3.2 貝萊斯芽孢桿菌No.4菌劑對抗性相關基因表達量的影響

WRKY轉錄因子是高等植物特殊的一類轉錄調控因子，可以響應各種生物和非生物的脅迫[26]。WRKY33轉錄因子對脫落酸的生物合成具有負調控作用[27]。本研究發現WRKY33基因表達上調，推測菌劑處理后可通過上調WRKY33基因表達，進而抑制脫落酸的合成，從而解除植株生長限制，促進植株生長，進而影響其它生理生化指標。處理組WRKY22基因表達量持續上調，這提示WRKY22、WRKY33轉錄因子可能參與響應貝萊斯芽孢桿菌的免疫應答，通過促進植株生長，進而提高植株的抗病性及抗逆性。GST1是一種誘導型啟動子[28]，可響應病原物的入侵，在植物抗病育種中常用其調控抗性基因的表達。本研究發現在36 h時，處理組GST1基因的表達量要高于對照組，推測菌劑處理可能誘導了GST1啟動子表達，進而調控了其它抗性基因的表達，提高了植株抗性，抑制病原物侵襲。

3.3 貝萊斯芽孢桿菌No.4菌劑能明顯減輕根部褐變

已有研究報道根系的破壞是黃龍病病原菌直接造成的，不是由于碳水化合物的缺乏[29]。通過根部嫁接可以傳播黃龍病[30]。根部腐爛是黃龍病病菌的直接危害癥狀[31]。因此，防治根部腐爛至關重要。本研究觀察到黃龍病為害的柑桔植株，根系發生褐變，內、外表皮細胞結構遭到破壞，這些特征和已有研究的結論是一致[32]。No.4菌劑處理后新生的根部表皮細胞結構完整，使根系褐變明顯減少，并促生新根生長，這些結果為如何緩解黃龍病造成的根系褐化及腐爛提供了新思路。因此，下一步可以通過剪除褐變部位根系，并用菌劑浸泡根部，促進根系生長，從根部降低或抑制病原，減輕地上部葉片黃化癥狀，降低或清除頂部莖尖所帶病原，為后續微芽嫁接提供適合的材料，有利于降低操作難度，既可提高成活率，又可提高脫毒效率。

此外，菌劑用量一定程度上影響植株的生長和代謝。為了不影響柑桔苗木的正常生長，本研究采用了逐步提高菌劑用量的方式對苗木進行處理：當苗木弱小時，菌劑用量過高會導致植株死亡；用量過低，則達不到抑制病原的效果。在植株生長發育階段，要加強肥水，促進苗木健壯生長，才能有針對性地設計菌劑使用劑量，避免因施用菌劑濃度過高，增量過猛，造成對苗木的傷害。

本研究從復合菌中分離出No.4菌株，并通過測序確定其分類地位為貝萊斯芽孢桿菌，該No.4菌株高強度的處理方式可以降低柑桔母本苗木韌皮部桿菌的病原滴度，促發新根，減少根系褐變現象的發生。本研究對于進一步開展莖尖微芽嫁接培育柑桔無病苗木有重要的指導意義，對于提高柑桔莖尖微芽嫁接的脫毒效果有著積極的作用。